t*x
发帖数: 1065 | 1 请问如果想要得到Lc-3II,就是结合在autophagosome上的lc-3的话，你们都用什么
buffer，或者detergent提？？
我遇到的问题是，细胞处理1小时就看到vesicle了，6个小时看到很多，体积也逐渐变
大的autophagosome,可是wester-blot就是看不到Lc-3II的增加，随着时间增加，
vesicle逐渐减少，却开始看到lc-3II的蛋白条带了，请问这正常么？？
我用0.5%triton-x 100然后挺强的sonication裂解的细胞，我担心的是autophagosome
膜上的蛋白不能完全裂解出来，所以请教大家。
看到有人用SDS, Urea什么的裂解，有必要么？？
谢谢指教！！ |
z****z
发帖数: 42 | 2 一般用RIPA
你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
Good luck. |
t*x
发帖数: 1065 | 3 呵呵，谢谢详细的回复！
那我就用RIPA buffer试一下
不过像你说的，如果这种现象正常的话，估计换了buffer也应该差不多的趋势。:)
刚开始的时候没有用sonication，只是0.5%triton X-100 30min 冰浴裂解
后来听别人建议，加了sonication,发现跑完westernblot，结果很一致，都是处理12小
时之后，在镜下观察发现vacuole都消失差不多了，才看到lc-3II的增加
呵呵，我以为是开始时lc3-II在vacuole膜上镶嵌，没有裂解下来，而时间长了
autophagosome跟lysosome结合吞噬，lc-3II被从膜上释放出来，成为cytosolic形式才
能被我检测到呢，所以一直在找比较强的裂解膜上蛋白的方法。
你这样说，我就比较放心了，恩，非常感谢！
western
【在 z****z 的大作中提到】
: 一般用RIPA
: 你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
: 看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
: 真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
: 超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
: Good luck.
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z****z
发帖数: 42 | 4 哦
用bafilomycin A吧，阻断LC3-II的降解。3-MA是阻断自噬体的形成。 |
q****2
发帖数: 208 | 5 能发发图看看，vesicle到底长啥样？ 我觉得有的细胞没处理也有 vesicle的样子 |
n**********1
发帖数: 251 | |
w*****y
发帖数: 35 | 7 完全不一样，autophagy vesicle里面有很多electron dense的黑黑的东西
【在 q****2 的大作中提到】
: 能发发图看看，vesicle到底长啥样？ 我觉得有的细胞没处理也有 vesicle的样子
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t*x
发帖数: 1065 | 8 哦，好，谢谢
其实我以前试过3-MA了,在我的系统中并没有显示阻断autophagy的作用
autophagosome照样形成
呵呵
恩，去看看bafilomycin A了，呵呵。
【在 z****z 的大作中提到】
: 哦
: 用bafilomycin A吧，阻断LC3-II的降解。3-MA是阻断自噬体的形成。
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t*x
发帖数: 1065 | 9 这样么？我还没做过电镜
不过在phase-contrast镜下看不到里面黑点点的东西
就是中间很透亮的泡状膜
【在 w*****y 的大作中提到】
: 完全不一样，autophagy vesicle里面有很多electron dense的黑黑的东西
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t*x
发帖数: 1065 | 10 有个别细胞没处理前确实也有vesicle
不过那是极少数的细胞，而且数目也并不多，在我看来应该是正常情况下的autophagy
不过，处理后的细胞很容易看出区别
几乎每个细胞里都有，而且随着时间的增加，数目越来越多，体积也越来越大
【在 q****2 的大作中提到】
: 能发发图看看，vesicle到底长啥样？ 我觉得有的细胞没处理也有 vesicle的样子
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t*x
发帖数: 1065 | 11 真的么？以前从没做过，所以对它非常生疏
不过最近的处理发现了这种现象才开始做的
呵呵
【在 n**********1 的大作中提到】
: 好像现在做这个东西的蛮多的，呵呵。
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h******y
发帖数: 1374 | 12 请问这些表达LC3II的细胞有没有可能也undergo senescence呢？
【在 t*x 的大作中提到】
: 真的么？以前从没做过，所以对它非常生疏
: 不过最近的处理发现了这种现象才开始做的
: 呵呵
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a*****v
发帖数: 128 | |
s*****g
发帖数: 7857 | 14 专家级的了!
western
【在 z****z 的大作中提到】
: 一般用RIPA
: 你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
: 看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
: 真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
: 超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
: Good luck.
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z*y
发帖数: 84 | 15 4 hours before you lyse the cells, add 10 ug/ml E-64d and 10 ug/ml Pepstatin
A to the medium. Then you can see the increase of LC3II.
Good luck. |
