t*x
发帖数: 1065 | 1 请问如果想要得到Lc-3II,就是结合在autophagosome上的lc-3的话，你们都用什么
buffer，或者detergent提？？
我遇到的问题是，细胞处理1小时就看到vesicle了，6个小时看到很多，体积也逐渐变
大的autophagosome,可是wester-blot就是看不到Lc-3II的增加，随着时间增加，
vesicle逐渐减少，却开始看到lc-3II的蛋白条带了，请问这正常么？？
我用0.5%triton-x 100然后挺强的sonication裂解的细胞，我担心的是autophagosome
膜上的蛋白不能完全裂解出来，所以请教大家。
看到有人用SDS, Urea什么的裂解，有必要么？？
谢谢指教！！ |
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t*x
发帖数: 1065 | 2 呵呵，谢谢详细的回复！
那我就用RIPA buffer试一下
不过像你说的，如果这种现象正常的话，估计换了buffer也应该差不多的趋势。:)
刚开始的时候没有用sonication，只是0.5%triton X-100 30min 冰浴裂解
后来听别人建议，加了sonication,发现跑完westernblot，结果很一致，都是处理12小
时之后，在镜下观察发现vacuole都消失差不多了，才看到lc-3II的增加
呵呵，我以为是开始时lc3-II在vacuole膜上镶嵌，没有裂解下来，而时间长了
autophagosome跟lysosome结合吞噬，lc-3II被从膜上释放出来，成为cytosolic形式才
能被我检测到呢，所以一直在找比较强的裂解膜上蛋白的方法。
你这样说，我就比较放心了，恩，非常感谢！
western |
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y*********e
发帖数: 7269 | 5 7月份的时候，出去玩，把Olympus 45mm/f1.8弄丢了
10月份的时候，不小心把Olympus E-P5给摔了，电池仓卡住了
11月份的时候，用了12年的Pentax FA31mm公主，突然AF不能无穷远对焦了
12月份的时候，摔了Pentax K-3 II上的Metz AF58闪光灯，连带把K-3II上面的闪光灯
热靴也给扯下来了。
年底开始想念老机器，把跟了我快20年，但是有近10年没有用的Pentax ME super拿出
来玩，结果发现反光镜锁定下不来了。
求2016年心里阴影面积。 |
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z****z
发帖数: 42 | 6 一般用RIPA
你说的现象正常，autophagsome多的时候，本身对LC-3II的降解很厉害，所以western
看不出来这个趋势，后来少的时候自噬能力减弱，反而能看见了。
真正体现的自噬流还得加抑制剂，试一下3-MA。
超声貌似没有必要，可以裂解时间长一点，加蛋白酶抑制剂，用小号的枪不断吹。
Good luck. |
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d*2
发帖数: 35 | 7 1. 首先看GFP－LC3， LC3-II，这个你做过了
2. In vitro 处理Bafilomycin或者Chloroquine，然后再看GFP－LC3， LC－II，这个
可以知道Flux
3. 或者用RFP－GFP－LC3看Flux
4. In vivo，染色看LC－3，如果可以的话，注射Bafilomycin，再看LC－3II的WB。或
者找reporter小鼠。P62可看可不看，毕竟能提供的信息量不多。 |
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