I*******U
发帖数: 869 | 1 最近要提取从白色脂肪里面提取SVF，根据protocol我确实看到了pellet，用TRI-
reagent也提取到了mRNA,nanodrop测出的浓度有800ng/ul，但是我试了cyclophilin，
gapdh，18s几个内参，都测不到CT值。已经重复几次了，郁闷的不行。请教各位，有什
么建议么？
SVF protocol
1）isolate WAT,
2) Incubate tissue @ 37C for 45min with shaking @ 80 rpm （Collagenase I，
1mg/ml）
3）300g for 10min
4) Dissolve pellet in Tri-reagent. | I*******U
发帖数: 869 | | I*******U
发帖数: 869 | | z****u
发帖数: 1007 | 4 换一下酶。我个人感觉collagenase不够强。组织解离不够。 我用collagenase 2mg/ml
+dispase. 或者直接上trypsin LE 都可以。
【在 I*******U 的大作中提到】
: 最近要提取从白色脂肪里面提取SVF，根据protocol我确实看到了pellet，用TRI-
: reagent也提取到了mRNA,nanodrop测出的浓度有800ng/ul，但是我试了cyclophilin，
: gapdh，18s几个内参，都测不到CT值。已经重复几次了，郁闷的不行。请教各位，有什
: 么建议么？
: SVF protocol
: 1）isolate WAT,
: 2) Incubate tissue @ 37C for 45min with shaking @ 80 rpm （Collagenase I，
: 1mg/ml）
: 3）300g for 10min
: 4) Dissolve pellet in Tri-reagent.
| I*******U
发帖数: 869 | 5 现在不是组织解离不够，我能拿到细胞，也能测到RNA 浓度，可是housekeeping gene
18s，GAPDH和Cyclophilin都测不出，这个是什么原因？
楼上的你有没有测过SVF的gene表达呢？用什么housekeeping gene呢？谢谢
ml
【在 z****u 的大作中提到】
: 换一下酶。我个人感觉collagenase不够强。组织解离不够。 我用collagenase 2mg/ml
: +dispase. 或者直接上trypsin LE 都可以。
| m***o
发帖数: 272 | 6 RNA 跑跑胶看看.如果housekeeping 都测不出,你拿到的那就不是RNA,或者是降解了.如
果RNA 确定没问题,是不是PCR 的reagent有问题了?拿一个阳性RNA 来测.一步一步的排
除,还能找不到原因? |
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