A****w
发帖数: 244 | 1 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
用了两种不同的方法，一个是BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA.
就是follow manual
另一是Bac to Bac system， 用cellfectin II reagent。
用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media （大于95％viability)
怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
然后amplification后也没有～
请大牛指教！
感谢！ |
n***3
发帖数: 663 | 2 是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9 cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？ |
m*******8
发帖数: 256 | 3
一般来说这种情况就是BACMID DNA有问题。
【在 A****w 的大作中提到】
: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
: 用了两种不同的方法，一个是BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA.
: 就是follow manual
: 另一是Bac to Bac system， 用cellfectin II reagent。
: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media （大于95％viability)
: 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
: 然后amplification后也没有～
: 请大牛指教！
: 感谢！
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A****w
发帖数: 244 | 4 BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的，可以看到pcr产物，难道
是transfection的量不够，用quick and dirty prep的。
》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9
cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
感觉是没有拿到baculovirus，细胞transfection 5－7天后，看不到涨大的病态细胞（
或者和control差别不大）看不出来。。。
有些时候看到是好多死细胞了，有的时候看起来还行。
》》“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？
就是在transfection后，有这个supernatant去infect健康的细胞（在T75里）。然后看
细胞形态，也做蛋白表达检测（western） |
T*****u
发帖数: 3257 | 5 我当时做的时候也是第一代看不明显蛋白也测不到表达。但是我再去扩增第二代就有了。
【在 A****w 的大作中提到】
: BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
: bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的，可以看到pcr产物，难道
: 是transfection的量不够，用quick and dirty prep的。
: 》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9
: cells
: 就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
: 感觉是没有拿到baculovirus，细胞transfection 5－7天后，看不到涨大的病态细胞（
: 或者和control差别不大）看不出来。。。
: 有些时候看到是好多死细胞了，有的时候看起来还行。
: 》》“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？
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B*****a
发帖数: 119 | 6 bac to bac
一大早提fresh的bacmid
你加8-10ug 的bacmid DNA （因为bacmid不会很纯）
等72个小时，~2ml 的P1 全用来做一盘子P2 |
A****w
发帖数: 244 | 7 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
还是用kit的啊？
【在 B*****a 的大作中提到】
: bac to bac
: 一大早提fresh的bacmid
: 你加8-10ug 的bacmid DNA （因为bacmid不会很纯）
: 等72个小时，~2ml 的P1 全用来做一盘子P2
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B*****a
发帖数: 119 | 8 MINIprep buffer I II III, 然后直接异丙醇沉淀， 不用column提纯
【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？
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B*****a
发帖数: 119 | 9 还有bacmid到P1，这步过了72h,infection不是很明显，但是P1到P2这步>48小时，会比
较明显。
真跟你的bacmid有没有insertion没有关系，全看titer
【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？
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I*****y
发帖数: 6402 | 10 get the PureLink kit to purify Bacmid
【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥？
: 是不是我上面提及的quick－and－dirty的方法
: 还是用kit的啊？
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S*******r
发帖数: 530 | 11 说的没错，bac to bac很有可能P1和P2的细胞形变都不明显。可以像上面某位说的那样
，P1全部用来做P2，做P3的时候多加P2。
P1，P2，P3的细胞都可以直接western，就知道蛋白是否表达。
【在 B*****a 的大作中提到】
: 还有bacmid到P1，这步过了72h,infection不是很明显，但是P1到P2这步>48小时，会比
: 较明显。
: 真跟你的bacmid有没有insertion没有关系，全看titer
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b******e
发帖数: 88 | 12 P1看不到很正常
你试试把2ml P1（3-4天）扔进10ml Sf9里,没隔一天查一次cell density
如果cell density加倍了就加midium稀释回2m
这样养4-5天看看，只要cell density不加倍了就说明成功了
另外cellfectin II reagent加多点，bacmid浓度大一些
【在 A****w 的大作中提到】
: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
: 用了两种不同的方法，一个是BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA.
: 就是follow manual
: 另一是Bac to Bac system， 用cellfectin II reagent。
: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media （大于95％viability)
: 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
: 然后amplification后也没有～
: 请大牛指教！
: 感谢！
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A****w
发帖数: 244 | |
x**2
发帖数: 255 | |
b******e
发帖数: 88 | 15 300ml P3 也就infect 15－20L 的cell， 这生意不错，呵呵
【在 x**2 的大作中提到】
: http://www.wistar.org/our-science/shared-resources-cores/protei
: 实在不放心，把bacmid送去让他们transfect，之后送300ml P3给你，300刀一次
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