B*****a
发帖数: 119 | 1 bac to bac
一大早提fresh的bacmid
你加8-10ug 的bacmid DNA （因为bacmid不会很纯）
等72个小时，~2ml 的P1 全用来做一盘子P2 |
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m*********r
发帖数: 49 | 2 最近在用invitrogen的bac to bac做表达，gene克隆到bacmid了之后，现在在转染（
transfection, 不知道翻译准不准）。前一次做的感染细胞放了一星期，monolayer都
要100%了，还没死，怀疑感染效率低。现在试第二次，已经转染后72-96小时了，发现
转染了bacmid的细胞除了长得比不加bacmid的对照长的慢点，好像很难看出来
invitrogen册子上说的细胞变大，出芽（这个我尤其难分辨）什么的（我平时也就用
200X inverted microscope观察），大家有比较明显的感染细胞和不感染细胞的对照图
推荐我瞧瞧么？我不想一直等到细胞dislodge了，或者裂解了才能知道感染成功没有。 |
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a******n
发帖数: 167 | 3 先克隆到bac-to-bac里面，用DH10Bac制作bacmid，用Cellfectin吧bacmid转进sf9，获
得P1 virus，然后amplify到P3。
P1和P2不是不可以用，只是titer很低。直接large scale结果相当烂。
P3收集多了，测过titer不错之后，可以用作seed做large scale（试过roller bottle
啥的，200mL）。
看似前期麻烦，但是比死命转不进去强多了。 |
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A****w
发帖数: 244 | 4 BD BaculoGold DNA ＋ pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的，可以看到pcr产物，难道
是transfection的量不够，用quick and dirty prep的。
》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊？我们做的时候7天以后Sf9
cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
感觉是没有拿到baculovirus，细胞transfection 5－7天后，看不到涨大的病态细胞（
或者和control差别不大）看不出来。。。
有些时候看到是好多死细胞了，有的时候看起来还行。
》》“amplification后也没有”是什么意思？没有检测到目标蛋白基因的表达？
就是在transfection后，有这个supernatant去infect健康的细胞（在T75里）。然后看
细胞形态，也做蛋白表达检测（western） |
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B*****a
发帖数: 119 | 5 还有bacmid到P1，这步过了72h,infection不是很明显，但是P1到P2这步>48小时，会比
较明显。
真跟你的bacmid有没有insertion没有关系，全看titer |
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h******y
发帖数: 173 | 6 我的bacmid.com就防在一个免费空间里，大半年了吧，比较稳定。对了，我网页上有链
接。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 7 ☆─────────────────────────────────────☆
happyfly (快乐小苍蝇) 于 (Fri Feb 24 03:44:20 2006) 提到:
我在e.coli和bacmid里表达一个小蛋白，大约8.7kD，检测用抗
c-末端的单抗，但在sds电泳中，能检测的信号基本上都在浓
缩胶里，只有极其微量的单体在8.7的位置上。看来这个蛋白是
以一种复合体的形式存在的，这个复合体不能被尿素、SDS和
巯基乙醇解离。初步分析发现复合体包含DNA/RNA，但不能被
核酸酶解离（可以完全被蛋白酶降解）。现在我们想得到单体
蛋白，但没有方法。
我个人感兴趣的是这个现象，就是有谁见过不能跑进分离胶的
蛋白吗？或者说蛋白能形成难解离的复合物吗？
欢迎讨论。
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royluo ( 罗马情结) 于 (Fri Feb 24 11:26:38 2006) 提到:
Where exactly does this band lrton.u] |
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h******y
发帖数: 173 | 9 Journal of Molecular Biology
Volume 210, Issue 4, 20 December 1989, Pages 721-736
Downstream sequences augment transcription from the essential initiation
site of a baculovirus polyhedrin gene
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2693741
Please send to - b****[email protected]
Thank you very much! |
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m*******8
发帖数: 256 | 12
一般来说这种情况就是BACMID DNA有问题。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 13 get the PureLink kit to purify Bacmid |
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b******e
发帖数: 88 | 14 P1看不到很正常
你试试把2ml P1（3-4天）扔进10ml Sf9里,没隔一天查一次cell density
如果cell density加倍了就加midium稀释回2m
这样养4-5天看看，只要cell density不加倍了就说明成功了
另外cellfectin II reagent加多点，bacmid浓度大一些 |
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B****m
发帖数: 63 | 16 转染后状态改变不大。
如果不确定的话，可以先表达GFP试试。
另外我的一个小tip：提bacmid的时候不需要用公司的盒子，提质粒的碱裂解法效果很
好。提取过程中动作轻柔点就行。 |
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