m*****n
发帖数: 760 | 1 目标蛋白大概60 kd
phospho-MS显示在C端有2个aa会被磷酸化。
没有phopspho-specific抗体
现在想看看磷酸化后在SDS-PAGE胶上会不会有shift
试了不同浓度的胶(8%,10%,12%,4-20%)，都没看到shift
想请教版上的各路大牛，这种大小的蛋白磷酸化之后会shift吗？
如果会shift的话，需要什么样的条件才能detect到？ |
g*****n
发帖数: 250 | 2 两个方法：1. 确定蛋白没有磷酸化，用磷酸酶处理。确定蛋白被磷酸化了，用激酶酶
处理。然后走胶比较。
2. 用phos-tag 胶。
如果有抗体，做western。 |
m*****n
发帖数: 760 | 3 只有目标蛋白的抗体，但是没有磷酸化特异性抗体。
样品在做phospho-MS时发现了这2个位点被磷酸化，
所以就做了western来看一下蛋白磷酸化之后有没有shift。
现在的问题是这个蛋白是不是太大了，所以1-2个位点的磷酸化并不太影响mobility
此外，多谢您的建议用phos-tag gel
以前没接触过这个，有没有比较好的reference?
【在 g*****n 的大作中提到】
: 两个方法：1. 确定蛋白没有磷酸化，用磷酸酶处理。确定蛋白被磷酸化了，用激酶酶
: 处理。然后走胶比较。
: 2. 用phos-tag 胶。
: 如果有抗体，做western。
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l*******1
发帖数: 16217 | 4 磷酸化后分子量基本不变，你可以试着做一个等电点的二维胶 |
c*********r
发帖数: 1312 | 5 同建议做2D-Gel，如果有抗体的话（不一定要识别磷酸化位点），在2D-western blot
上应该能看到磷酸化之后等电点变化。
给你看一个我之前实验室的图：
【在 m*****n 的大作中提到】
: 目标蛋白大概60 kd
: phospho-MS显示在C端有2个aa会被磷酸化。
: 没有phopspho-specific抗体
: 现在想看看磷酸化后在SDS-PAGE胶上会不会有shift
: 试了不同浓度的胶(8%,10%,12%,4-20%)，都没看到shift
: 想请教版上的各路大牛，这种大小的蛋白磷酸化之后会shift吗？
: 如果会shift的话，需要什么样的条件才能detect到？
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c*********r
发帖数: 1312 | 6 我们做的这个蛋白有很多个磷酸化位点，所以看到有很多“点”。根据报道，这个蛋白
，只有在多个位点被heavily磷酸化之后才会在1D SDS-PAGE上有“分子量”/迁移率的
变化。 |
w******u
发帖数: 32 | 7 native gel 啊
【在 m*****n 的大作中提到】
: 目标蛋白大概60 kd
: phospho-MS显示在C端有2个aa会被磷酸化。
: 没有phopspho-specific抗体
: 现在想看看磷酸化后在SDS-PAGE胶上会不会有shift
: 试了不同浓度的胶(8%,10%,12%,4-20%)，都没看到shift
: 想请教版上的各路大牛，这种大小的蛋白磷酸化之后会shift吗？
: 如果会shift的话，需要什么样的条件才能detect到？
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w*******d
发帖数: 396 | |
s********1
发帖数: 20 | |
K******S
发帖数: 10109 | 10 MS都有了还跑胶干什么?
【在 m*****n 的大作中提到】
: 目标蛋白大概60 kd
: phospho-MS显示在C端有2个aa会被磷酸化。
: 没有phopspho-specific抗体
: 现在想看看磷酸化后在SDS-PAGE胶上会不会有shift
: 试了不同浓度的胶(8%,10%,12%,4-20%)，都没看到shift
: 想请教版上的各路大牛，这种大小的蛋白磷酸化之后会shift吗？
: 如果会shift的话，需要什么样的条件才能detect到？
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l*******1
发帖数: 16217 | |
g*****n
发帖数: 250 | 12 图很漂亮。你怎么确定这个等电点变化是磷酸化的结果, 而不是其它修饰的结果.
blot
【在 c*********r 的大作中提到】
: 同建议做2D-Gel，如果有抗体的话（不一定要识别磷酸化位点），在2D-western blot
: 上应该能看到磷酸化之后等电点变化。
: 给你看一个我之前实验室的图：
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