m******t
发帖数: 109 | 1 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
请教做过的各位了。 |
p******b
发帖数: 379 | 2 裂解液不够强？ histone可能需要比较强的去垢剂 |
r******k
发帖数: 446 | 3 我就用1 percent的 sds的RIPA。 但是最主要的是你的GEL是不是15%的？因为histone
很小 如果不是 你肯定跑不出来 histone是非常strong的band 我5ug都能做出来。。 |
s**2
发帖数: 1287 | 4 acidic extraction
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
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t******k
发帖数: 599 | |
f*******d
发帖数: 92 | 6 Histone 是很容易做的，要sonicate cell lysates, 确保细胞核裂解，RIPA buffer绝
对没问题。如果没有的话，1% SDS ＋ heating也很容易看到，如果还看不到的话，用
8M UREA+RIPA, 这样的话，即使在胶上都能看到很强的band. 此外这个protein特别小
，好像15还是18kD, 所以胶别跑过了。 |
z*t
发帖数: 863 | 7 正解，好使
【在 s**2 的大作中提到】
: acidic extraction
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A******y
发帖数: 2041 | 8 No need for acidic extraction. Sonication will do. Using abcam chip grand
HH3 antibody 1/10,000 will give you less than 1 sec exposure. |
O**********a
发帖数: 317 | 9 很简单，我给你个protocol：
1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
清晰的三条组蛋白带（H3、H2A／2B，H4），一般还能看到上面一条组蛋白H1。western
更是没问题了。
4. 当然第2步之后你也可以用TCA沉淀：加1/2体积的100%TCA（终浓度33%），冰上沉淀
30min，最大转速4度离心10分钟，保留pellet，加1ml丙酮洗涤，最大转速4度离心10分
钟，保留pellet。用丙酮反复洗涤3次，室温空气中20分钟晾干，用水或者适当的
buffer重悬，－20保存或者下一步分析。
ps 37.5% HCl约等于 12.2M, 也就是12.2当量（12.2N）
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
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C******0
发帖数: 42 | 10 正解！
20
loading
【在 O**********a 的大作中提到】
: 很简单，我给你个protocol：
: 1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
: 2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
: PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
: 1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
: HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
: 第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
: 度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
: 3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
: buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
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j***x
发帖数: 1469 | |
c*****u
发帖数: 439 | 12 loading buffer 直接煮，蛋白胶都能看到。如果你做不出来，只能是你western有问题
。 |
O**********a
发帖数: 317 | 13 有DNA混在里面不会拖尾么
我还是喜欢酸抽，干净啊，跑出来的条带好看
【在 c*****u 的大作中提到】
: loading buffer 直接煮，蛋白胶都能看到。如果你做不出来，只能是你western有问题
: 。
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