g******r
发帖数: 139 | 1 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
觉，SYBR的chemistry的稳定性不好，导致well之间跳跃性很大。而taqman assay 就没
有这个问题。
不知道我的感觉对不对。谢谢 |
B******o
发帖数: 496 | 2 if your gene is very lowly expressed, big variations between replicates can
be possible. Otherwise, it is the way you handle the sample that causes the
problem.
Sybr Green assay is as sensitive as Taqman assay. I don't think ABI(life
tech)'s claim is true that Taqman is more sensitive.
cycle
【在 g******r 的大作中提到】
: 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
: 最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
: 不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
: 验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
: 过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
: 上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
: 超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
: 应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
: bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
: 当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
|
g******r
发帖数: 139 | 3 这里不是sensitivity的问题，是同一样品的replicates之间有较大的误差。至于样品
操作，我对我的所有加样步骤有信心，可以排除。
我问过旁边实验室一个同事，他只用过SYBR，这个问题也常常出现。而我作了6个
taqman assay的plate，没有一个well是outlier.
can
the
【在 B******o 的大作中提到】
: if your gene is very lowly expressed, big variations between replicates can
: be possible. Otherwise, it is the way you handle the sample that causes the
: problem.
: Sybr Green assay is as sensitive as Taqman assay. I don't think ABI(life
: tech)'s claim is true that Taqman is more sensitive.
:
: cycle
|
z********8
发帖数: 818 | 4
can
the
完全正确。还有一个可能是仪器老了。
【在 B******o 的大作中提到】
: if your gene is very lowly expressed, big variations between replicates can
: be possible. Otherwise, it is the way you handle the sample that causes the
: problem.
: Sybr Green assay is as sensitive as Taqman assay. I don't think ABI(life
: tech)'s claim is true that Taqman is more sensitive.
:
: cycle
|
l*******i
发帖数: 153 | 5 我做qPCR时，即使cycle达到35，36（endogenous control在16-18），replicate之间
也很少查0.5以上。
如果你对你的加样很有信心的话，注意两个问题：
1）你的板子是不是有点脏？
2）机器需要校验了。 |
a******a
发帖数: 283 | 6 我的体会是SYBR的背景比taqman要大。是不是更加sensitive这个很难说，但是如果背
景很大的话，就容易出现无法读取低信号的问题。
taqman相对来说干净很多。我常用的对照样品，不是每次，但是基本上也是plate-to-
plate的差异很小，在0.3到0.8之间。
个人偏爱Taqman，觉得SYBR麻烦很多。尤其是最近出现的一系列问题，对SYBR失去耐心
了。
【在 l*******i 的大作中提到】
: 我做qPCR时，即使cycle达到35，36（endogenous control在16-18），replicate之间
: 也很少查0.5以上。
: 如果你对你的加样很有信心的话，注意两个问题：
: 1）你的板子是不是有点脏？
: 2）机器需要校验了。
|
a***y
发帖数: 19743 | 7 用过taqman也用过SYBR
没有感觉有明显差异。
感觉是你的机器，或者加样上面的问题。
cycle
【在 g******r 的大作中提到】
: 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
: 最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
: 不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
: 验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
: 过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
: 上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
: 超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
: 应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
: bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
: 当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
|
g******r
发帖数: 139 | 8 板子用的同一批次，应该是干净的。至于检验机器，这个是很可能。每次用这个
ABI7500 fast的时候都说什么calibration expried, do you want to continue (
something like this)。
但是相同时间下Taqman assay没有问题。是不是这个机器校正过期对SYBR的影响特别大
，但对Taqman assay没有什么影响呢？
但是确实这个可能是原因，也许需要做SYBR的校正，而taqman assay用其它的filter,
可能还不受影响。
【在 l*******i 的大作中提到】
: 我做qPCR时，即使cycle达到35，36（endogenous control在16-18），replicate之间
: 也很少查0.5以上。
: 如果你对你的加样很有信心的话，注意两个问题：
: 1）你的板子是不是有点脏？
: 2）机器需要校验了。
|
P***w
发帖数: 67 | 9 看了一圈回复，悲哀，这个版的理论水平在持续下滑。
楼主先去搞懂taqman, SYBR的原理，然后再讨论什么能造成variation |
g******r
发帖数: 139 | 10 牛人都不发言，当然水平就下滑了。只是所谓Taqman,SYBR的原理还是知道的。
【在 P***w 的大作中提到】
: 看了一圈回复，悲哀，这个版的理论水平在持续下滑。
: 楼主先去搞懂taqman, SYBR的原理，然后再讨论什么能造成variation
|
|
|
g******r
发帖数: 139 | 11 谢谢，可能是机器需要SYBR的校正。等作完校正后再比较一下。
【在 a***y 的大作中提到】
: 用过taqman也用过SYBR
: 没有感觉有明显差异。
: 感觉是你的机器，或者加样上面的问题。
:
: cycle
|
A******y
发帖数: 2041 | 12 Did you check linearity of your primer? Seriously. |
g******r
发帖数: 139 | 13 我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
product,怎么解释replicate well之间的差异呢？
【在 A******y 的大作中提到】
: Did you check linearity of your primer? Seriously.
|
w*****y
发帖数: 1201 | 14 你用的是谁家的SYBR，你的primer特异性如何？
cycle
【在 g******r 的大作中提到】
: 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
: 最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
: 不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
: 验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
: 过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
: 上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
: 超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
: 应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
: bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
: 当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
|
g******r
发帖数: 139 | 15 Invitrogen的SYBR® Select Master Mix。
我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
product,怎么解释replicate well之间的差异呢？
【在 w*****y 的大作中提到】
: 你用的是谁家的SYBR，你的primer特异性如何？
:
: cycle
|
A******y
发帖数: 2041 | 16 Melting curve or gel product do not tell you linearity.
【在 g******r 的大作中提到】
: Invitrogen的SYBR® Select Master Mix。
: 我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
: product,怎么解释replicate well之间的差异呢？
|
l******a
发帖数: 3339 | 17 大牛来给我们讲讲吧，小的们实验不一定做得好，原理还是懂的。
【在 P***w 的大作中提到】
: 看了一圈回复，悲哀，这个版的理论水平在持续下滑。
: 楼主先去搞懂taqman, SYBR的原理，然后再讨论什么能造成variation
|
w*****y
发帖数: 1201 | 18 我的理解是，SYBR是针对所有dsDNA，特异性要求比较高，我一般设计primer的时候，
会设计primer cross exon-intron splicing site，这样即使RNA有轻微的DNA污染，不
会对结果有影响，你的primer是如何设计的？
【在 g******r 的大作中提到】
: Invitrogen的SYBR® Select Master Mix。
: 我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
: product,怎么解释replicate well之间的差异呢？
|
c****1
发帖数: 1095 | 19 不知你的replicates是怎么弄的，一般来说，对每一个反应，我是弄一个master mix
for 4.2~5 wells，然后充分混匀（这点很重要，我是用vortex），然后再aliquot到4
个孔里。重要原则就是要保证replicates都是一模一样的。我经常只弄2~3 replicates
。replicates的扩增曲线几乎完全重合。 |
l***s
发帖数: 841 | 20 0.3-0.8 的误差已经很大了。一般来说不应超过0.3才对。很多人和我抱怨过qPCR，但
我发现他们大多数都用错了primer的浓度，根本没法保证efficiency。 每个primer至
少要0.2uM才行。
【在 a******a 的大作中提到】
: 我的体会是SYBR的背景比taqman要大。是不是更加sensitive这个很难说，但是如果背
: 景很大的话，就容易出现无法读取低信号的问题。
: taqman相对来说干净很多。我常用的对照样品，不是每次，但是基本上也是plate-to-
: plate的差异很小，在0.3到0.8之间。
: 个人偏爱Taqman，觉得SYBR麻烦很多。尤其是最近出现的一系列问题，对SYBR失去耐心
: 了。
|
|
|
g******r
发帖数: 139 | 21 Primer是从sigma买来的，都是选的cross exon-intron splicing site。但是假设是
primer不好，跟replicate well差异大有什么潜在联系吗？
【在 w*****y 的大作中提到】
: 我的理解是，SYBR是针对所有dsDNA，特异性要求比较高，我一般设计primer的时候，
: 会设计primer cross exon-intron splicing site，这样即使RNA有轻微的DNA污染，不
: 会对结果有影响，你的primer是如何设计的？
|
g******r
发帖数: 139 | 22 能展开讲讲么？primer lineartity对replicates的潜在影响是什么？谢谢
【在 A******y 的大作中提到】
: Melting curve or gel product do not tell you linearity.
|
g******r
发帖数: 139 | 23 当然对这样的实验使用total tube是必须的。
4
replicates
【在 c****1 的大作中提到】
: 不知你的replicates是怎么弄的，一般来说，对每一个反应，我是弄一个master mix
: for 4.2~5 wells，然后充分混匀（这点很重要，我是用vortex），然后再aliquot到4
: 个孔里。重要原则就是要保证replicates都是一模一样的。我经常只弄2~3 replicates
: 。replicates的扩增曲线几乎完全重合。
|
g******r
发帖数: 139 | 24 你说得很对，我实验中使用0.3uM的primer。但假设primer浓度不够，导致efficiency
不好，但这能导致replicates差异大么？理论上所有的well是一样的low efficiency。
【在 l***s 的大作中提到】
: 0.3-0.8 的误差已经很大了。一般来说不应超过0.3才对。很多人和我抱怨过qPCR，但
: 我发现他们大多数都用错了primer的浓度，根本没法保证efficiency。 每个primer至
: 少要0.2uM才行。
|
A******y
发帖数: 2041 | 25 If you are not in the linear rage, it is very possible you will have
significant different C(t) when you do the experiment. The whole point of
out of linear range is that you will have erratic unpredictable data.
【在 g******r 的大作中提到】
: 能展开讲讲么？primer lineartity对replicates的潜在影响是什么？谢谢
|
s******y
发帖数: 28562 | 26 SYBR system 天生就比Taqman 的特异性差一些，在实践上，线性区间也差一些。但是
差别没有那么大。
你的问题主要应该是PCR condition 没有优化，检测的有效Ct区间不高。
注意你用的SYBR premix 和你的Taqman premix 不是同一个buffer, 不能直接比较优化
度。
大部分realtime PCR premix 的有效线形区间是12-25.对于高Ct sample误差变大的原
因主要是在那些区间的反应已经不再是线性，而是会受一些随机因素很大的影响。
我的建议是，加大你的样品的上量，尽量把有效Ct控制在30之内。如果你没有办法控制
上样量的话，那么就需要优化条件，去试探镁离子组合，dNTP含量，annealing
temperature, extension duration等等条件，把你的线性区间调到高Ct区。
cycle
【在 g******r 的大作中提到】
: 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
: 最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
: 不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
: 验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
: 过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
: 上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
: 超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
: 应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
: bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
: 当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
|
g******r
发帖数: 139 | 27 OK,what you mean is the cDNA concentration used should be in the linear
region of the reaction.
This concentration would vary for each of the genes, dependent on the
abundance. I did not perform such cDNA dilution pilot experiment for each
gene. I just used 2-4 ng cDNA in the real-time PCR. One would assume the
gene with Ct of 25-31 is within the linear range, if the Ct is >33, it is
possible the cDNA conc is kind of out the range.
And it is true as Isaid that I got no outlier replicates for genes with low
Ct, such GAPDH and some target genes, when the Ct is lower than 25-26. But
all genes with Ct higher than 27 have bigger error bar. I assume it is still
within the linear range and SYBR can handle such situation. And I know
taqman assay can handle genes with Ct around 33-34 perfectly without
outliers.
So far I cannot understand what is the exact cause for the erratic
unpredictable data, but one way to get around this is to use higher cDNA,
trying to bring the Ct back to 25-26 range.
There are many drawbacks for this approch. First, it is tedious, and I
cannot perform multiple genes with the same condition at the same time.
Second, my GAPDH reference may be at the lower end the linear range, which
may not serve as a good reference anymore. Third, for some genes with high
Ct as 33-34, it is difficult to bring back to 25-26 range because it needs
much more RNA and cDNA to do this.
I hope the calibration of this ABI 7500 fast can help to solve the problem
in some way.
Thanks for your input.
【在 A******y 的大作中提到】
: If you are not in the linear rage, it is very possible you will have
: significant different C(t) when you do the experiment. The whole point of
: out of linear range is that you will have erratic unpredictable data.
|
g******r
发帖数: 139 | 28 Hi Sunny, 谢谢你的建议。我目前的情况是同一台机器对taqman assay可以handle Ct
33-34，而SYBR只能到25左右。尽管我做的不是一样的样品，但也许这两种方法之间的
差别还真就这么大。
不过我还对SYBR只能handle Ct around 25还是很吃惊，预期是３０左右吧。但你也这
么说，很可能就是这种技术的极限吧。
我用的是SYBR® Select Master Mix from Invitrogen，能改的条件是加大上样量
，退火温度和延伸温度。用目前的条件作全部的gene，得到大致的趋势。然后根据结果
再对有问题的gene加大量，以期得到更加可靠的结论。
【在 s******y 的大作中提到】
: SYBR system 天生就比Taqman 的特异性差一些，在实践上，线性区间也差一些。但是
: 差别没有那么大。
: 你的问题主要应该是PCR condition 没有优化，检测的有效Ct区间不高。
: 注意你用的SYBR premix 和你的Taqman premix 不是同一个buffer, 不能直接比较优化
: 度。
: 大部分realtime PCR premix 的有效线形区间是12-25.对于高Ct sample误差变大的原
: 因主要是在那些区间的反应已经不再是线性，而是会受一些随机因素很大的影响。
: 我的建议是，加大你的样品的上量，尽量把有效Ct控制在30之内。如果你没有办法控制
: 上样量的话，那么就需要优化条件，去试探镁离子组合，dNTP含量，annealing
: temperature, extension duration等等条件，把你的线性区间调到高Ct区。
|
s******y
发帖数: 28562 | 29 Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
程度不一样。
如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
没那么大。
对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
新配更
浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
如果你真的有特殊原因要用SYBR，那么建议你直接搬用Taqman buffer（不加probe即可
），然后自己手工加SYBR-green and DMSO, 而不是从头优化Invitrogen buffer.
Ct
【在 g******r 的大作中提到】
: Hi Sunny, 谢谢你的建议。我目前的情况是同一台机器对taqman assay可以handle Ct
: 33-34，而SYBR只能到25左右。尽管我做的不是一样的样品，但也许这两种方法之间的
: 差别还真就这么大。
: 不过我还对SYBR只能handle Ct around 25还是很吃惊，预期是３０左右吧。但你也这
: 么说，很可能就是这种技术的极限吧。
: 我用的是SYBR® Select Master Mix from Invitrogen，能改的条件是加大上样量
: ，退火温度和延伸温度。用目前的条件作全部的gene，得到大致的趋势。然后根据结果
: 再对有问题的gene加大量，以期得到更加可靠的结论。
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g******r
发帖数: 139 | 30 再问一下，你是用SYBR还是taqman?
【在 l*******i 的大作中提到】
: 我做qPCR时，即使cycle达到35，36（endogenous control在16-18），replicate之间
: 也很少查0.5以上。
: 如果你对你的加样很有信心的话，注意两个问题：
: 1）你的板子是不是有点脏？
: 2）机器需要校验了。
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A******y
发帖数: 2041 | 31 Are you telling me that you did not validate your primer amplification
efficiency? You input cDNA is total cDNA, you don't need to adjust every
time, but you do need to check your primer linearity and amplification
efficiency. If you didn't, please tell that to the reviewers, lol. Btw, I
have seen primers that are good in taqman that are completely useless in
SYBR rxn.
Btw, show me you actually validate your amplification efficiency and
linearity before we keep talking.
low
still
【在 g******r 的大作中提到】
: OK,what you mean is the cDNA concentration used should be in the linear
: region of the reaction.
: This concentration would vary for each of the genes, dependent on the
: abundance. I did not perform such cDNA dilution pilot experiment for each
: gene. I just used 2-4 ng cDNA in the real-time PCR. One would assume the
: gene with Ct of 25-31 is within the linear range, if the Ct is >33, it is
: possible the cDNA conc is kind of out the range.
: And it is true as Isaid that I got no outlier replicates for genes with low
: Ct, such GAPDH and some target genes, when the Ct is lower than 25-26. But
: all genes with Ct higher than 27 have bigger error bar. I assume it is still
|
B******o
发帖数: 496 | 32 Sunny, 你的说法不正确。Sybr和Taqman在sensitivity上是一样的, Sybr green与
double strand DNA结合，而taqman依靠PCR酶酶切活性来使原本quench的fluorescent
dye发光。 ABI常宣称说Taqman更specific，因为需要probe和target sequence结合才
会被PCR酶切到。实际上，这个hybridization的过程也有non-specific binding的，它
并没有提高PCR本身的sensitivity，而只是免去了看melting curve的必要. Sybr
Green的方法结合melting curve在sensitivity上和taqman一样。
我临时查了一下就发现了很多文章表达了同样的看法，http://mic.sgmjournals.org.proxy1.athensams.net/content/149/1/269.short
很多人的bias仅仅是公司特意宣传下被欺骗了而已。
前面ArtyArty说的很中肯，楼主连自己primer的线性扩增好不好都没测过，显然在很多
技术细节上并不清楚
【在 s******y 的大作中提到】
: SYBR system 天生就比Taqman 的特异性差一些，在实践上，线性区间也差一些。但是
: 差别没有那么大。
: 你的问题主要应该是PCR condition 没有优化，检测的有效Ct区间不高。
: 注意你用的SYBR premix 和你的Taqman premix 不是同一个buffer, 不能直接比较优化
: 度。
: 大部分realtime PCR premix 的有效线形区间是12-25.对于高Ct sample误差变大的原
: 因主要是在那些区间的反应已经不再是线性，而是会受一些随机因素很大的影响。
: 我的建议是，加大你的样品的上量，尽量把有效Ct控制在30之内。如果你没有办法控制
: 上样量的话，那么就需要优化条件，去试探镁离子组合，dNTP含量，annealing
: temperature, extension duration等等条件，把你的线性区间调到高Ct区。
|
l***y
发帖数: 638 | 33 理论上讲Taqman的特异性要高过sybr green，因为它只有在probe结合在PCR扩增的区间
才会有信号，PCR的non-specific amplification或者probe的non-specific binding两
者之一的情况都不会产生信号，而sybr green只要有非特异PCR扩增就会出信号
另外Taqman可以做internal control，一个孔同时测未知基因和housekeeping，可以降
低部分variation。
Taqman就是太贵了，一般做做实验sybr green也就差不多了，反正qPCR也就是一个data
，真要做solid肯定得有其他independent的方法验证。
fluorescent
【在 B******o 的大作中提到】
: Sunny, 你的说法不正确。Sybr和Taqman在sensitivity上是一样的, Sybr green与
: double strand DNA结合，而taqman依靠PCR酶酶切活性来使原本quench的fluorescent
: dye发光。 ABI常宣称说Taqman更specific，因为需要probe和target sequence结合才
: 会被PCR酶切到。实际上，这个hybridization的过程也有non-specific binding的，它
: 并没有提高PCR本身的sensitivity，而只是免去了看melting curve的必要. Sybr
: Green的方法结合melting curve在sensitivity上和taqman一样。
: 我临时查了一下就发现了很多文章表达了同样的看法，http://mic.sgmjournals.org.proxy1.athensams.net/content/149/1/269.short
: 很多人的bias仅仅是公司特意宣传下被欺骗了而已。
: 前面ArtyArty说的很中肯，楼主连自己primer的线性扩增好不好都没测过，显然在很多
: 技术细节上并不清楚
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B******o
发帖数: 496 | 34 probe's non-specific binding can generate signal as well, as long as the
amplified DNA has similar sequence that can hybridize with the probe. It
really depends on how the probe is designed.
As for Sybr Green assay, it is necessary to check melting curve every time.
If any non-specific amplification were present, the curve wont be a single
peak.
data
【在 l***y 的大作中提到】
: 理论上讲Taqman的特异性要高过sybr green，因为它只有在probe结合在PCR扩增的区间
: 才会有信号，PCR的non-specific amplification或者probe的non-specific binding两
: 者之一的情况都不会产生信号，而sybr green只要有非特异PCR扩增就会出信号
: 另外Taqman可以做internal control，一个孔同时测未知基因和housekeeping，可以降
: 低部分variation。
: Taqman就是太贵了，一般做做实验sybr green也就差不多了，反正qPCR也就是一个data
: ，真要做solid肯定得有其他independent的方法验证。
:
: fluorescent
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s******y
发帖数: 28562 | 35 这个我不太同意。
首先，这两者的理论sensitivity的确差不多，而且在某种程度上来说，Sybr green因
为信号强度大，其实在检测上更容易被仪器看到。不过，你要是真的两者都做一次你就
知道了，对于含量特别低的样品，Sybr green的信号强度根本没有什么用，因为不同重
复孔跑出来的差别太大了（类似楼主看到的这个问题），导致那些跑出来的常常都是废
数据，所以真实的有效敏感度没有那么高。
另外，你可能对Taqman 的特异性的理解有些偏差。那个fluorescent probe, 要产生荧
光必须有两个条件：1，必须在template 上有PCR reaction 在进行； 2。probe 必须
能够结合在template 上面。必须两个条件同时满足，缺一不可，如果仅仅是probe非特
异结合是没有荧光的。
但是对于Sybr-green, 只要满足第一个条件就可以有信号了。
这样一来，Taqman qPCR 和Sybr-green 的特异性向比较就类似于Nested PCR 和普通
PCR的差别，前者在理论上肯定比后者更特异。
另外，Sybr-green 对于高Ct 的样品，光看melting curve 是不行的。因为在我的实践
中，如果超过了35Ct, 样品中常常会因为non-specific reaction 的积累而出现smear,
而且很多情况下是比较随机而且均匀的smear, 基本上你是在melting curve 里看不到
的。这个必须跑胶和空白组对照才能看出。smear 毫无疑问是可以导致Sybr-green的信
号的，但是一般都不会导致Taqman probe 发出信号。
fluorescent
【在 B******o 的大作中提到】
: Sunny, 你的说法不正确。Sybr和Taqman在sensitivity上是一样的, Sybr green与
: double strand DNA结合，而taqman依靠PCR酶酶切活性来使原本quench的fluorescent
: dye发光。 ABI常宣称说Taqman更specific，因为需要probe和target sequence结合才
: 会被PCR酶切到。实际上，这个hybridization的过程也有non-specific binding的，它
: 并没有提高PCR本身的sensitivity，而只是免去了看melting curve的必要. Sybr
: Green的方法结合melting curve在sensitivity上和taqman一样。
: 我临时查了一下就发现了很多文章表达了同样的看法，http://mic.sgmjournals.org.proxy1.athensams.net/content/149/1/269.short
: 很多人的bias仅仅是公司特意宣传下被欺骗了而已。
: 前面ArtyArty说的很中肯，楼主连自己primer的线性扩增好不好都没测过，显然在很多
: 技术细节上并不清楚
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l***s
发帖数: 841 | 36 SYBR Ct 35肯定就测不准了。一般不要超过33. 只要有RNA表达（哪怕很低），这个都
不应该是个问题。大多数读数都在30以下，很少超过32. Replicate之间误差一般在0.0
-0.2之间。 若Ct读数太高，大多情况下是primer设计的太糟糕，效率低下。每次我用
新primer之前，都要检验一下，确保效率，特异性都没问题。对于没用过的primers，
先跑QC，有问题的primer比例很低，只有10%左右需要重新设计。其实TaqMan对懒人来
说比较合适，因为primer，master mix什么的，条件都已经optimized,直接用就行了。
若经常做qPCR的，SYBR是即实惠又可靠的选择，完全没必要买那么贵的TaqMan assays。
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个我不太同意。
: 首先，这两者的理论sensitivity的确差不多，而且在某种程度上来说，Sybr green因
: 为信号强度大，其实在检测上更容易被仪器看到。不过，你要是真的两者都做一次你就
: 知道了，对于含量特别低的样品，Sybr green的信号强度根本没有什么用，因为不同重
: 复孔跑出来的差别太大了（类似楼主看到的这个问题），导致那些跑出来的常常都是废
: 数据，所以真实的有效敏感度没有那么高。
: 另外，你可能对Taqman 的特异性的理解有些偏差。那个fluorescent probe, 要产生荧
: 光必须有两个条件：1，必须在template 上有PCR reaction 在进行； 2。probe 必须
: 能够结合在template 上面。必须两个条件同时满足，缺一不可，如果仅仅是probe非特
: 异结合是没有荧光的。
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B******o
发帖数: 496 | 37 smear出现的话melting curve不会是单峰，很容易分辨的
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个我不太同意。
: 首先，这两者的理论sensitivity的确差不多，而且在某种程度上来说，Sybr green因
: 为信号强度大，其实在检测上更容易被仪器看到。不过，你要是真的两者都做一次你就
: 知道了，对于含量特别低的样品，Sybr green的信号强度根本没有什么用，因为不同重
: 复孔跑出来的差别太大了（类似楼主看到的这个问题），导致那些跑出来的常常都是废
: 数据，所以真实的有效敏感度没有那么高。
: 另外，你可能对Taqman 的特异性的理解有些偏差。那个fluorescent probe, 要产生荧
: 光必须有两个条件：1，必须在template 上有PCR reaction 在进行； 2。probe 必须
: 能够结合在template 上面。必须两个条件同时满足，缺一不可，如果仅仅是probe非特
: 异结合是没有荧光的。
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s******y
发帖数: 28562 | 38 要看是什么样的smear. 如果是很浅而且很均匀的smear, 每个小峰都很矮，看起来就是
一堆很小的小波浪在baseline 上。经验不多的人不一定会注意到。还有时候杂峰会叠
加在主峰上，形成一个胖峰而不是独立的峰。
http://www.researchgate.net/publictopics.PublicPostFileLoader.h
【在 B******o 的大作中提到】
: smear出现的话melting curve不会是单峰，很容易分辨的
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z*******6
发帖数: 679 | 39 大家有人用HMS的那个qPCR primer bank吗？里面有很多都validate过的... 我感觉很
好用...
看了几位大牛的回复，确实到不少东西... 但技术层面上讲，我也差不多是相信32以下
的，然后再用几次独立实验reproduce... 我的ct一般在0.3到0.5以内... 用的是
repeater和排枪的组合...
嗯，看了大家的回复，我也在想我要不要做一个amplification efficiency的test和
linearity的test... |
a******a
发帖数: 283 | 40 胖头鱼先生能不能分享一下手动加SYBR green的体会和心得？我从来没这么做过，很好
奇。
谢谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
: 一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
: 程度不一样。
: 如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
: 没那么大。
: 对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
: 新配更
: 浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
: sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
: 你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
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m***o
发帖数: 272 | 41 support!有时即使用一种tissue verify 了primer的efficiency，换个组织有时还会不
同的efficiency。
I
【在 A******y 的大作中提到】
: Are you telling me that you did not validate your primer amplification
: efficiency? You input cDNA is total cDNA, you don't need to adjust every
: time, but you do need to check your primer linearity and amplification
: efficiency. If you didn't, please tell that to the reviewers, lol. Btw, I
: have seen primers that are good in taqman that are completely useless in
: SYBR rxn.
: Btw, show me you actually validate your amplification efficiency and
: linearity before we keep talking.
:
: low
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s******y
发帖数: 28562 | 42 没啥特别的， 就是把各种东西，包括buffer, dntp, primer,water, sybrgreen, DMSO
, taq
polymerase 都先混合好作为母液，然后分装到管子或者孔里去。最后再把template 加
进每一个管子里，然后离心甩一下。
其实就是把公司的premix 自己装一下。 不知道这个是不是你想问的？
【在 a******a 的大作中提到】
: 胖头鱼先生能不能分享一下手动加SYBR green的体会和心得？我从来没这么做过，很好
: 奇。
: 谢谢！
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A******y
发帖数: 2041 | 43 That should be the first experiment you do when you got the primers....
【在 z*******6 的大作中提到】
: 大家有人用HMS的那个qPCR primer bank吗？里面有很多都validate过的... 我感觉很
: 好用...
: 看了几位大牛的回复，确实到不少东西... 但技术层面上讲，我也差不多是相信32以下
: 的，然后再用几次独立实验reproduce... 我的ct一般在0.3到0.5以内... 用的是
: repeater和排枪的组合...
: 嗯，看了大家的回复，我也在想我要不要做一个amplification efficiency的test和
: linearity的test...
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s******y
发帖数: 28562 | 44 agree
【在 A******y 的大作中提到】
: That should be the first experiment you do when you got the primers....
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s******y
发帖数: 435 | 45 1. 样品上样前没有混匀
2. 上样误差
3. 机器托盘脏了
cycle
【在 g******r 的大作中提到】
: 请大牛指教，是不是SYBR作real-time PCR比Taqman assay稳定性差很多？
: 最近有些实验，用SYBR的时候replicate well之间的variation很大，从0.5到2个cycle
: 不等, 导致error bar很大，很难看，即使用了four replicates也不是很理想。有时试
: 验组比对照组的值少了50%，也不知道是不是真的。Ct值越小的gene，误差就越小，超
: 过25cycles的gene就很容易出现跳跃。
: 上样时我极度小心，没有气泡。我看过我的plate，well之间的体积相差极小，不可能
: 超过5%的误差。adhesive cover密封的应该也没有问题。
: 应该也不是plate的问题，同一批次的plate用作taqman assay时就非常完美，error
: bar 极小，所以操作上应该也不是问题。都用得是ABI7500 fast.
: 当然，我不是用taqman assay来重复SYBR的试验，不是完全一样的比较。只是有一种感
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J*****8
发帖数: 6 | 46 我以前试过ABI的sybgreen，发现粘性很大，就算是做master mix然后分到每个孔里，
体积都不一样，因为有滞留在tip里，所以我喜欢biorad的。 |
g******r
发帖数: 139 | 47 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1= R0 (1+ER)CtR1
。X0/X1=(1+EX)CtX1-CtX0 (1+ER)CtR0-CtR1。可以看到如果EX=85%， ER=95%，对最
终结果的影响也不是很大。当然如果EX只有50%或更差，当然对结果会有很大的影响，
但是这也是对表达量的影响，还是不能解释我replicate之间的差异。
但是显然如果EX只有50%或更差，表明我的实验条件完全没有优化，在EX只有50%或更差
的情况下，replicate之间就特别容易出现跳跃式的误差。
我从sigma订立6对primer，都是cross exon to exon，只有gapdh 和另外一个gene的Ct
低于25(同时error bar也很小)，另外四个的Ct从27-35不等，每一个都有较大的误差，
极端情况下，8个细胞系里5个都有很大的误差。这个订primer失败的机会也太大了吧。
而同一个机器对taqman assay可以handle Ct=34-35。这个如果不是由于taqman assay
和SYBR之间的差别的话(既然楼上很多同学都认为两种方法的差别不是27-35Ct这样的巨
大差别)，就是说自己随机选择primer的失败率很高，而taqman assay也许都是事先经
过了validation。也就是说便宜不省事，省事不便宜。当然我选SYBR也是图便宜。
回到我的实验来，如果是primer效率很低，那么另外订两队primer per gene也许能降
低Ct，只有把Ct降低到22-25的范围内我才可能测primer效率，否则我也没有办法对
cDNA作那么多serial dilution，除非我真有一个overexpression 的细胞系。另外我使
用的是两个primer都是0.3 uM，也许调整一下浓度也能改变一些，但是能从31 降低到
25吗？这看起来也不是很现实的目标。
I
【在 A******y 的大作中提到】
: Are you telling me that you did not validate your primer amplification
: efficiency? You input cDNA is total cDNA, you don't need to adjust every
: time, but you do need to check your primer linearity and amplification
: efficiency. If you didn't, please tell that to the reviewers, lol. Btw, I
: have seen primers that are good in taqman that are completely useless in
: SYBR rxn.
: Btw, show me you actually validate your amplification efficiency and
: linearity before we keep talking.
:
: low
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D***a
发帖数: 516 | 48 ChIP－QPCR的Ct大都高于30，你怎么办？
【在 s******y 的大作中提到】
: Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
: 一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
: 程度不一样。
: 如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
: 没那么大。
: 对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
: 新配更
: 浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
: sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
: 你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
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g******r
发帖数: 139 | 49 上Taqman,呵呵。用SYBR你有知道可靠的primer,error bar也很小，或者重复性很好，
结果也是可以用的。
【在 D***a 的大作中提到】
: ChIP－QPCR的Ct大都高于30，你怎么办？
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A******y
发帖数: 2041 | 50 Wrong! Efficiency will affect ddC(t). I give you a hint, my old lab used
to troubleshoot for invitrogen RT-PCR mix and we mostly use ddC(t). A
primer that is not in its linear range behave erratically with no tread to
follow. I have seen non-linear primers not moving C(t) at all or with lower
C(t) when there are more cDNA.
I know a lot of people don't check their primer efficiencies, and now you
see why people think there are so much BS in the bio-field. You are doing
your experiment WRONG. Why you don't just check your primer efficiency, it
should be the first thing you do anyway.
CtR1
【在 g******r 的大作中提到】
: 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
: 底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
: 影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
: 的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
: 发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
: 以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
: 为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
: knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
: 达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
: Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1= R0 (1+ER)CtR1
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