x********e
发帖数: 35261 | 1 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 没空debug的，摇20个试管，combine中提不就行了
【在 x********e 的大作中提到】
: 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
: 活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
: 结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？
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a****d
发帖数: 1919 | 3 isopropanol precipitation -20度 overnight， then spin down |
r***e
发帖数: 2539 | 4 你怎么知道是降解？产量少？是不是抗生素不行了啊，摇时间长了就这样。
【在 x********e 的大作中提到】
: 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
: 活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
: 结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？
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s**2
发帖数: 1287 | 5 如果是Amp抗性的话，摇菌别超过14小时。或者用carbenicillin
【在 x********e 的大作中提到】
: 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
: 活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
: 结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？
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i***l
发帖数: 1656 | 6 见过这种（2例）
1.路霉素扩增质粒不扩增细菌
2用小管（同楼上） 或者固体平板长，平板长完了刮下来细菌用 |
x********e
发帖数: 35261 | 7 这样么？那为什么摇5ml没问题，以前其他质粒中提也没问题
【在 s**2 的大作中提到】
: 如果是Amp抗性的话，摇菌别超过14小时。或者用carbenicillin
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x********e
发帖数: 35261 | 8 现在就准备这么做
【在 s******s 的大作中提到】
: 没空debug的，摇20个试管，combine中提不就行了
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x********e
发帖数: 35261 | 9 菌浓度正常，用isopropanol提完跑胶发现100bp以下有很亮的一团，质粒所在的条带浓
度却很特别低
摇了大概16小时
【在 r***e 的大作中提到】
: 你怎么知道是降解？产量少？是不是抗生素不行了啊，摇时间长了就这样。
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s******s
发帖数: 13035 | 10 和生长曲线有关。你如果严格控制接种方法，接种量，时间等，
大瓶子多半也能摇出来，不过一般不值得这么做，直接多摇几
管子就行了
【在 x********e 的大作中提到】
: 这样么？那为什么摇5ml没问题，以前其他质粒中提也没问题
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b*****s
发帖数: 169 | 11 你检查下你中提的kit有没有加RNase
【在 x********e 的大作中提到】
: 菌浓度正常，用isopropanol提完跑胶发现100bp以下有很亮的一团，质粒所在的条带浓
: 度却很特别低
: 摇了大概16小时
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a******g
发帖数: 71 | 12 同意楼上，RNA把柱子给饱和了
【在 b*****s 的大作中提到】
: 你检查下你中提的kit有没有加RNase
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s*****g
发帖数: 7857 | 13 我曾大提死活出不来，最后换了新买的抗生素Amp，出来了！
【在 r***e 的大作中提到】
: 你怎么知道是降解？产量少？是不是抗生素不行了啊，摇时间长了就这样。
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x********e
发帖数: 35261 | 14 加了 跟试剂无关
用QIAGEN的kit或者isopropanol提都不行
【在 b*****s 的大作中提到】
: 你检查下你中提的kit有没有加RNase
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x********e
发帖数: 35261 | 15 我是有positive ctrl的
空载体没问题，有insertion的不行。而且insertion的位置貌似还有关系
【在 s*****g 的大作中提到】
: 我曾大提死活出不来，最后换了新买的抗生素Amp，出来了！
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r******k
发帖数: 446 | 16 我maxiprep的时候遇到过类似情况，miniprep没问题，但是maxiprep出来的consturct
，transfect到细胞里面的时候就是表达不出蛋白。后来发现可能是maxiprep的时候用
枪吹的太剧烈了，导致dna被切断了，跑胶的时候很多弥散。 |
r********n
发帖数: 164 | 17 我遇到过好多次很类似的情况，应该是construct某种原因不稳定或者有一定毒性。我
出现问题的construct里面共同点是有很多loxP site，还有很多别的重复的sequence。
Culture总是无法扩大。没有这些序列的载体就没什么问题。最后合并了多个小culture
来提高产量。另外我的经验是这些construct在耐受性好的细胞里稳定些，比如NEB的5-
alpha F'Iq或者Invitrogen的stbl cell。
【在 x********e 的大作中提到】
: 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
: 活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
: 结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？
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t*****z
发帖数: 1598 | 18 顶。是这个道理。没有抗生素的选择压力，细菌就倾向于不保留质粒。
【在 r***e 的大作中提到】
: 你怎么知道是降解？产量少？是不是抗生素不行了啊，摇时间长了就这样。
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m*****z
发帖数: 1451 | 19 最后怎么解决的？我现在面临同样的问题，更惨的是我连小提都拿不到质粒了。。。
culture
5-
【在 r********n 的大作中提到】
: 我遇到过好多次很类似的情况，应该是construct某种原因不稳定或者有一定毒性。我
: 出现问题的construct里面共同点是有很多loxP site，还有很多别的重复的sequence。
: Culture总是无法扩大。没有这些序列的载体就没什么问题。最后合并了多个小culture
: 来提高产量。另外我的经验是这些construct在耐受性好的细胞里稳定些，比如NEB的5-
: alpha F'Iq或者Invitrogen的stbl cell。
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x********e
发帖数: 35261 | 20 你怎么知道是对的菌呢？如果小提都没有，可能根本没质粒啊
【在 m*****z 的大作中提到】
: 最后怎么解决的？我现在面临同样的问题，更惨的是我连小提都拿不到质粒了。。。
:
: culture
: 5-
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S***a
发帖数: 257 | 21 我刚遇到类似的问题解决了，希望解决方案对你有帮助。
我的质粒表达hairpin shRNA,对细菌有毒性。涂板的时候克隆长出来没有问题，但是摇
菌的时候长的不好，拿到的质粒dna浓度很稀。
我是买来的质粒，所以打电话问了公司客服。他们建议：
1.用 terrific broth (TB)而不是普通LB摇菌；
2.用 carbenicillin，不要用Ampicillin (如果你的细菌是amp抗性的话）；
3.如果还不行，可以尝试room temperature 摇菌两到三天。
我的问题换了TB就解决了，祝你好运！ |
L****T
发帖数: 169 | 22 你咋测定质粒浓度的？如果像你描述这样电泳结果，很可能大部分EB被前面的RNA结合
了，说不定你质粒的量其实还可以。另外肯定一点你大抽Kit的RNase不足。
【在 x********e 的大作中提到】
: 菌浓度正常，用isopropanol提完跑胶发现100bp以下有很亮的一团，质粒所在的条带浓
: 度却很特别低
: 摇了大概16小时
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x********e
发帖数: 35261 | 23 取1ul跑电泳，EB不可能被RNA deplete
之所以觉得是降解的DNA而不是RNA，是因为我两个样品一个是摇了马上提，另一个过了
两三个小时后提，后者的非特异条带比前者亮很多
【在 L****T 的大作中提到】
: 你咋测定质粒浓度的？如果像你描述这样电泳结果，很可能大部分EB被前面的RNA结合
: 了，说不定你质粒的量其实还可以。另外肯定一点你大抽Kit的RNase不足。
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m*****z
发帖数: 1451 | 24 colony genotyping是对的。。。。
【在 x********e 的大作中提到】
: 你怎么知道是对的菌呢？如果小提都没有，可能根本没质粒啊
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l*****g
发帖数: 43 | 25 质粒不稳定，size down了，降低温度到30度过夜，应该可以解决问题 |
l*****g
发帖数: 43 | 26 病毒载体这种情况也不少，我用30度长过夜解决问题。换Stabl3或者4对于我的经验是
效果有限。 |
x********e
发帖数: 35261 | 27 30度是个什么原理呢？我只知道BAC有的是要在30度摇
【在 l*****g 的大作中提到】
: 病毒载体这种情况也不少，我用30度长过夜解决问题。换Stabl3或者4对于我的经验是
: 效果有限。
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q***7
发帖数: 144 | |
E*****i
发帖数: 2 | |
s**********a
发帖数: 92 | 30 我遇到过类似情况，最后问题竟然是 isoproponol，可能分装到塑料管里的失效了，后
来用的原装棕色瓶里的，问题就解决了。之前浪费了好多maxi。
【在 x********e 的大作中提到】
: 最近构建了几个12k的construct, 小提酶切检验送测序都没问题。但当我想做中提就死
: 活做不出。目前troubleshooting的结果是做50-100ml的overnight culture质粒就会降
: 结解。有人遇到过类似的情况吗？有没有好的解决方法？
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x********e
发帖数: 35261 | 31 我的问题更离奇一点。我的positive ctrl质粒中提一点问题没有。最后是做了好多个小
提合一起解决的。TE溶的时候发现DNA特别难溶解，我放37度摇床里过夜了precipitati
on才消失。不知道是不是这个原因用kit提不出来。
【在 s**********a 的大作中提到】
: 我遇到过类似情况，最后问题竟然是 isoproponol，可能分装到塑料管里的失效了，后
: 来用的原装棕色瓶里的，问题就解决了。之前浪费了好多maxi。
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