J******9
发帖数: 736 | 1 新课题，需要培养小鼠侧脑室（LV）取材的神经干细胞(NSC，)，进行“悬浮培养神经
球（neurosphere）。我也是第一次接触这个技术，很多方面不懂，虽然看了不少参考
资料。
我的大致实验步骤：LV切割下来后，消化细胞，细胞板计数后，按照5000个细胞/孔，
每孔0.5ml 液体量，接种到non-treated 24-wells培养板，进行悬浮生长。
培养基为：DMEM/F12, bFGF,EGF, B27, N2。（每2-3天添加新鲜培养液0.5ml。）
今天是接种第9天，显微镜下观察，大量悬浮细胞，成片状，中间夹着着一些小的“神
经球”。
问题：
1， 组织消化后接种，那些非神经干细胞来源的细胞，12-24小时后就不能存活了，
成为死细胞。这些死细胞如何可以从培养孔中清除？因为我每隔2天，仅仅添加等量的
新鲜培养基，那些死细胞仍然残留在培养孔里面。今天是第9天，虽然能看到神经球，
但是神经球周围大量成片的死细胞，很影响照相。
2， 我这种情况，是否需要“半量换液”来清除死细胞？大家是如何进行半量换液
的？看了不少文献，还是有点模糊。
3， 我的取材是1月龄、3月龄小鼠两组动物，请问这种月龄的小鼠，LV来源的NSC，
在培养第9-10天，神经球的数量和体积是不是应该很多、很大？我观察我的样本，神经
球很少（一个孔，不超过10个神经球），体积也很小。 |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 不会， adult NSC培养的前一个礼拜neurosphere 很少的
你看到的大部分片状的东西不是细胞，应该是debris， 等到能看到neurophere的时候
要通过离心来除掉debris
我们都是养在flask里面，长出大量neurosphere以后在dissociate，然后进行下一步试
验的， 那种直接养96孔板， 离心去debris 貌似比较麻烦 |
J******9
发帖数: 736 | 3 谢谢赐教~！再追问几个技术问题：
1，如何通过离心去掉debris ？多少rpm？如果离心的话，神经球和debris不是都沉底
了吗？
2，你们原代养在flask里面的神经球，一般多久可以长出大量的神经球？ 如何提取神
经球？也就是只含有神经球，没有那些细胞杂质和碎片。如果能将神经球与其他死细胞
、组织碎片杂质分离出来，那么接下来的实验，就容易多了。
谢谢指点·！
【在 h*******o 的大作中提到】
: 不会， adult NSC培养的前一个礼拜neurosphere 很少的
: 你看到的大部分片状的东西不是细胞，应该是debris， 等到能看到neurophere的时候
: 要通过离心来除掉debris
: 我们都是养在flask里面，长出大量neurosphere以后在dissociate，然后进行下一步试
: 验的， 那种直接养96孔板， 离心去debris 貌似比较麻烦
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J******9
发帖数: 736 | 4 另外，在falsk里面养悬浮神经球，半量换液，如何操作？
吸管吸取瓶子里面陈旧培养液的时候，不是有可能将神经球也顺带吸取出来了吗？ |
t******k
发帖数: 599 | 5 我换液一般都是离心，2000rpm，10min，1000rpm也可以。感觉挺干净的。 |
J******9
发帖数: 736 | |
h*******o
发帖数: 4884 | 7 我现在直接就是买的公司的试剂，然后用的公司的protocol
stemcell techonology
具体的楼主自己找把，贴在这里有拉广告的嫌疑。 |
