B****w
发帖数: 48 | 1 我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
质粒？ |
q***7
发帖数: 144 | 2 没有问题，用PCR进行点突变就是类似这么干的。是做突变吗？干吗要用１KB做引物？
你可以在希望扩增停止的地方用酶切开，线性化估计会好些。
你可以用这个公司的DNTP，便宜又好用。还有他们提PCR和DNA片段回收的试剂盒（２合
一）。不象QIAGEN的试剂盒回收的DNA片段中混有洗液而影响克隆效率。
http://www.greenbioresearch.com/dntp-sets-dntp-mix/
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification |
B****w
发帖数: 48 | 3 刚刚试了一下！好像不行呀！出来的都是Smear.用的酶是phusion, 94度变性，72度退
火延伸。 |
j****x
发帖数: 1704 | 4 phusion需要99度变性
这酶挺好用的，仔细看说明书吧
【在 B****w 的大作中提到】
: 刚刚试了一下！好像不行呀！出来的都是Smear.用的酶是phusion, 94度变性，72度退
: 火延伸。
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q***7
发帖数: 144 | 5 建议用３步PCR，另外，应该用PHUSION变性一般用９８C |
q***7
发帖数: 144 | 6 如果用１KB做引物，我建议你同时再加你５＇端的一般引物，根据你目的，量上要调整
模板等 |
d****h
发帖数: 46 | 7 不知扩增的目的是什么？
如果是要插入大的片段的话，可以用一对反向无重叠反向primer，一步PCR扩增整个
plasmid。如果是点突变，可以把突变位点加入到这对primer两端。不需要切质粒。
---forward primer
5‘-----------------------------------------------
3’-----------------------------------------------
reverse----
【在 B****w 的大作中提到】
: 我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
: primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
: 质粒？
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M******g
发帖数: 152 | 8 you can also try Q5 polymerase, and gibson assembly from NEB. They are very
powerful to do mutagenesis, insertion big fragments etc. |
