C*******e
发帖数: 4348 | 1 最近做一个蛋白A
高pI（>9)
已知蛋白A跟蛋白B，或者蛋白B+C有相互作用
于是共表达然后纯化复合物
纯化过程中用detergent啊，lyzosome啊
DNase还有RNase啊
结果破碎细胞以后离心得到的pellet，还有得到的复合物pellet都超级难resuspend的
一整块像Jelly的东西
能弄成大小碎块但是没有办法混匀
用针头反复吸吹也不行
加Uear到5M也不行
参考了一些提纯histone protein的protocol，
加HCl到0.25M也没有办法完全溶解
求建议！ |
C*********m
发帖数: 213 | 2
你的蛋白复合物不溶的？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 最近做一个蛋白A
: 高pI（>9)
: 已知蛋白A跟蛋白B，或者蛋白B+C有相互作用
: 于是共表达然后纯化复合物
: 纯化过程中用detergent啊，lyzosome啊
: DNase还有RNase啊
: 结果破碎细胞以后离心得到的pellet，还有得到的复合物pellet都超级难resuspend的
: 一整块像Jelly的东西
: 能弄成大小碎块但是没有办法混匀
: 用针头反复吸吹也不行
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 如果直接把纯化好的蛋白A和B加在一起
立刻沉淀了
摩尔比例试过从1：64到16：1
所以尝试共表达
希望能够得到一些可溶的复合物
【在 C*********m 的大作中提到】
:
: 你的蛋白复合物不溶的？
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 上清有一些复合物吧
SEC的话，蛋白A显示是3聚体，B是6聚体
不过A是3聚体应该不是真的，有别的实验数据显示这个蛋白是非常flexible的长杆子状
的，应该是单体 |
C*******e
发帖数: 4348 | 5 哦，蛋白B，C的pI正常，都是5左右的
但是跟蛋白A的相互作用应该不是由表面电荷相反造成的non-specific interaction
用一些能买到的high pI蛋白做过control试验 |
l**********1
发帖数: 5204 | 6 you can try Dynabeads
i.e.
PMID 22991688
Denisin AK et al.
Post-collection processing of Schirmer strip-collected human tear fluid
impacts protein content. (2012).
Analyst. 137: 5088-96.
recombinant human lysozyme 14 kDa, pI=10.2–11
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22991688
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果直接把纯化好的蛋白A和B加在一起
: 立刻沉淀了
: 摩尔比例试过从1：64到16：1
: 所以尝试共表达
: 希望能够得到一些可溶的复合物
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s******y
发帖数: 28562 | 7 听起来是你的两个蛋白会形成比较复杂的高聚物或者aggregate
有没有考虑过大大降低你的蛋白的浓度？
另外，一个方法就是把其中一个蛋白crosslink 到agarose 的表面，这样一样就不会
形成aggregate了，因为其中一个的分布浓度被强行固定了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果直接把纯化好的蛋白A和B加在一起
: 立刻沉淀了
: 摩尔比例试过从1：64到16：1
: 所以尝试共表达
: 希望能够得到一些可溶的复合物
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起？
还是说共表达的这一步，比如不加IPTG，同时表达groESL之类的？
忘了说，蛋白A有一个GSTtag的version
用过magnetic beads
一样的，上清液一加到magnetic beads以后
beads立刻变成一整块，完全没有办法吹洗
就好像被什么东西crosslink了一样
【在 s******y 的大作中提到】
: 听起来是你的两个蛋白会形成比较复杂的高聚物或者aggregate
: 有没有考虑过大大降低你的蛋白的浓度？
: 另外，一个方法就是把其中一个蛋白crosslink 到agarose 的表面，这样一样就不会
: 形成aggregate了，因为其中一个的分布浓度被强行固定了。
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 可以给一下文献链接么？
另外有没有推荐的commercial available GROES菌株？
fold |
s******y
发帖数: 28562 | 10 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起
听起来貌似是你的那个蛋白A有aggregate 的倾向，很有可能是没有完全折叠正确
（当然也有可能是它本来就是这样），
【在 C*******e 的大作中提到】
: 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起？
: 还是说共表达的这一步，比如不加IPTG，同时表达groESL之类的？
: 忘了说，蛋白A有一个GSTtag的version
: 用过magnetic beads
: 一样的，上清液一加到magnetic beads以后
: beads立刻变成一整块，完全没有办法吹洗
: 就好像被什么东西crosslink了一样
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C*********m
发帖数: 213 | 11 如果是actin 这样的polymer 就基本无解了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果直接把纯化好的蛋白A和B加在一起
: 立刻沉淀了
: 摩尔比例试过从1：64到16：1
: 所以尝试共表达
: 希望能够得到一些可溶的复合物
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 谢谢！
我们的确考虑蛋白A可能就是intrinsically disordered proteins
不过蛋白B，C都是有结构的 |
C*******e
发帖数: 4348 | 13 我是觉得在体外形成正确的复合物的可能性比较低啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起
: 听起来貌似是你的那个蛋白A有aggregate 的倾向，很有可能是没有完全折叠正确
: （当然也有可能是它本来就是这样），
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 应该不是
不过研究actin的都是用什么样的手段呢？
【在 C*********m 的大作中提到】
: 如果是actin 这样的polymer 就基本无解了。
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s******y
发帖数: 28562 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 16 有分开的纯蛋白
但是in vitro能够正确self assembly的可能性是不是比in vivo小点呢
【在 s******y 的大作中提到】
: 咦？我貌似觉得原楼主提到过有分开的纯蛋白？
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s******y
发帖数: 28562 | 17 一般来说。。。如果纯蛋白能溶的话，一般都是折叠正确了的。
当然也有例外。比方说如果带电量很强的话，有时候会出现所谓的soluble aggregate
，就是单独的情况下能溶解，但是一碰到什么核心立刻就纠缠起来沉了。
你这个情况听起来有点象这个情况。
既然你说了A蛋白用GST-bead的话会导致迅速aggregate, 你是否试验过把B蛋白先
cross-link 在什么bead 上，然后去结合低浓度的纯化之后的A?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有分开的纯蛋白
: 但是in vitro能够正确self assembly的可能性是不是比in vivo小点呢
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 我可能没说清楚
GST-A蛋白如果用GST resin的话是可以纯化,并且浓缩的
我是说如果GST-A,B共表达,用GST的magnetic beads做in vitro pull-down
上吸铁石,
很快beads变成一整片
没有办法吸吹
我不能说是A或者A+B aggregate了
是bead变成一整片无法分开
当然具体什么原因我不知道
aggregate
【在 s******y 的大作中提到】
: 一般来说。。。如果纯蛋白能溶的话，一般都是折叠正确了的。
: 当然也有例外。比方说如果带电量很强的话，有时候会出现所谓的soluble aggregate
: ，就是单独的情况下能溶解，但是一碰到什么核心立刻就纠缠起来沉了。
: 你这个情况听起来有点象这个情况。
: 既然你说了A蛋白用GST-bead的话会导致迅速aggregate, 你是否试验过把B蛋白先
: cross-link 在什么bead 上，然后去结合低浓度的纯化之后的A?
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 还是希望能够在溶液里,不是semi-solid phase
B是可以self assembly的
用tag之类的cross-link在bead上会有些别的问题
aggregate
【在 s******y 的大作中提到】
: 一般来说。。。如果纯蛋白能溶的话，一般都是折叠正确了的。
: 当然也有例外。比方说如果带电量很强的话，有时候会出现所谓的soluble aggregate
: ，就是单独的情况下能溶解，但是一碰到什么核心立刻就纠缠起来沉了。
: 你这个情况听起来有点象这个情况。
: 既然你说了A蛋白用GST-bead的话会导致迅速aggregate, 你是否试验过把B蛋白先
: cross-link 在什么bead 上，然后去结合低浓度的纯化之后的A?
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s******y
发帖数: 28562 | 20 应该就是Aggregate, 导致带有那些蛋白的bead被胶结到一起了。
如果你的两个蛋白分别表达的时候都可溶而且能够纯化得到纯体的话，
要研究复合体的时候就只好用低浓度溶液，或者用semi solid phase 了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我可能没说清楚
: GST-A蛋白如果用GST resin的话是可以纯化,并且浓缩的
: 我是说如果GST-A,B共表达,用GST的magnetic beads做in vitro pull-down
: 上吸铁石,
: 很快beads变成一整片
: 没有办法吸吹
: 我不能说是A或者A+B aggregate了
: 是bead变成一整片无法分开
: 当然具体什么原因我不知道
:
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 请问有没有类似的文献推荐？
【在 s******y 的大作中提到】
: 应该就是Aggregate, 导致带有那些蛋白的bead被胶结到一起了。
: 如果你的两个蛋白分别表达的时候都可溶而且能够纯化得到纯体的话，
: 要研究复合体的时候就只好用低浓度溶液，或者用semi solid phase 了。
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b******y
发帖数: 627 | 22 My guess is that A protein is probably multivalent, i.e. one A protein can
bind more than on B. Even if one A can only bind one B, GST is a dimer and a
GST-A dimer can bind two B and increase the local concentration of B.
Furthermore, Glutathione bead substantiates the local concentration effect
by binding more than one GST-A dimer in the vicinity of each other. As such,
the self-assembly activity of B is greatly increased and the whole system
including all beads, all GST-A and all B forms a single giant hydrol-gel
phase. Depending on the self-assembly affinity of B, the physical property
of the hydrogel varies greatly. If the affinity is low, the hydrogel is sort
of viscous and can still be pipetted up and down. If the affinity is
intermediate, it will be super viscous and it is hard to pipetted up and
down. If the affinity is high or even forms amyloid, you get a real solid,
which is even SDS-resistant. |
C*******e
发帖数: 4348 | 23 我遇到的情况很像你说的high affinity情况下的hydrol-gel
请问如果是这样
想要研究A+B interaction，有什么建议么？
a
such,
sort
【在 b******y 的大作中提到】
: My guess is that A protein is probably multivalent, i.e. one A protein can
: bind more than on B. Even if one A can only bind one B, GST is a dimer and a
: GST-A dimer can bind two B and increase the local concentration of B.
: Furthermore, Glutathione bead substantiates the local concentration effect
: by binding more than one GST-A dimer in the vicinity of each other. As such,
: the self-assembly activity of B is greatly increased and the whole system
: including all beads, all GST-A and all B forms a single giant hydrol-gel
: phase. Depending on the self-assembly affinity of B, the physical property
: of the hydrogel varies greatly. If the affinity is low, the hydrogel is sort
: of viscous and can still be pipetted up and down. If the affinity is
|
b******y
发帖数: 627 | 24 If you are only interested in A/B interaction, why not delete self-
oligomeriztion domain of B?
Just out of curiosity, is A or B, the high pI one, a RNA binding protein? |
C*******e
发帖数: 4348 | 25 呃，整个protein B就是self-oligomerization domain
A是high pI protein
应该不是RNA binding protein
不过pI那么高，non-specific的跟DNA,RNA结合一点也不奇怪
不过目前也没发现A蛋白有DNA或者RNA binding motif
不过我们不是做nucleic acid binding protein的
有没有比较新比较全的数据库可以推荐呢？
原核的，不是真核
【在 b******y 的大作中提到】
: If you are only interested in A/B interaction, why not delete self-
: oligomeriztion domain of B?
: Just out of curiosity, is A or B, the high pI one, a RNA binding protein?
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 protein B没有问题
已经研究得比较多
知道的也比protein A多得多
还有各种X-ray结构已知
B不是单体 |
C*******e
发帖数: 4348 | 27 以你见过那么多high pi蛋白的经验给一点建议吧 |
b******n
发帖数: 4225 | 28 也有可能跟DNA/RNA形成了复合物（不管是特异性的还是非特异性的）
你可以尝试一下periplasm表达系统
如果还是很粘稠，可能是蛋白形成了polymer或者aggregation
【在 C*******e 的大作中提到】
: 最近做一个蛋白A
: 高pI（>9)
: 已知蛋白A跟蛋白B，或者蛋白B+C有相互作用
: 于是共表达然后纯化复合物
: 纯化过程中用detergent啊，lyzosome啊
: DNase还有RNase啊
: 结果破碎细胞以后离心得到的pellet，还有得到的复合物pellet都超级难resuspend的
: 一整块像Jelly的东西
: 能弄成大小碎块但是没有办法混匀
: 用针头反复吸吹也不行
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 GST-A.B co-expression pls let IPTG and the cultures were maintained at 4°C
for 48-72 h then do that induction
reference:
PMID 23525091
Production of soluble eukaryotic recombinant proteins in E. coli is favoured
in early log-phase cultures induced at low temperature. (2012).
Springerplus. 2:89.
FINDINGS:
A high yield of active soluble proteins was obtained by combining early-log
phase cultures and low temperatures for protein induction. When IPTG was
added at OD600 = 0.1 and cultures were maintained at 4°C for 48
-72 h, the soluble protein yield was 3 fold higher than that obtained in the
mid-log phase (OD600 = 0.6). Besides, the target protein
expression increased and the endogenous bacterial proteins reduced, thus
making the protein purification process easier and more efficient.
CONCLUSIONS:
The protocol can be widely applied to proteins with a heterologous
expression which was limited by loss of activity at high temperatures or by
low soluble recombinant protein yield.
web link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23525091
or
The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at
low growth temperatures. (2007).
Biotechnol Bioeng. 96: 1101-6.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17013944
The reason host strain hsp70/90 caused misfold
PMID 21775628
Chaperone-mediated hierarchical control in targeting misfolded proteins to
aggresomes. (2011).
Mol Biol Cell. 22: 3277-88.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21775628
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我可能没说清楚
: GST-A蛋白如果用GST resin的话是可以纯化,并且浓缩的
: 我是说如果GST-A,B共表达,用GST的magnetic beads做in vitro pull-down
: 上吸铁石,
: 很快beads变成一整片
: 没有办法吸吹
: 我不能说是A或者A+B aggregate了
: 是bead变成一整片无法分开
: 当然具体什么原因我不知道
:
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 请不要纠结蛋白B了可以么
就是我表达的蛋白B的结构也有了
SEC也是单峰
另外还有SAXS数据等等。。。。。。
现在要研究的是A
我们只知道A和B一定有相互作用
native species里in vivo有selfassembly的complex
不过种种原因没有办法从native source提纯研究
A直接做SEC显示是三聚体
不过别的实验数据倾向于应该不够compact的单体
A+B一混就沉淀，上清基本没有蛋白（BCA assay)
没有办法A+B过柱子
B。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 那我还是建议你先把蛋白B偶联在bead 上，然后再加低浓度的A吧。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 请不要纠结蛋白B了可以么
: 就是我表达的蛋白B的结构也有了
: SEC也是单峰
: 另外还有SAXS数据等等。。。。。。
: 现在要研究的是A
: 我们只知道A和B一定有相互作用
: native species里in vivo有selfassembly的complex
: 不过种种原因没有办法从native source提纯研究
: A直接做SEC显示是三聚体
: 不过别的实验数据倾向于应该不够compact的单体
|
C*******e
发帖数: 4348 | 32 谢谢建议
【在 s******y 的大作中提到】
: 那我还是建议你先把蛋白B偶联在bead 上，然后再加低浓度的A吧。
|
z******i
发帖数: 120 | 33 Most likely they formed aggregate.
I had experience like that when mix A and B.
It's a headache.
Finally, I tried to fusion ed the smaller one with GST tag, and succeed.
If doesn't work, try MBP fusion. Or even try both fusioned with soluble tags.
Please let me know if you solve the problem.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 最近做一个蛋白A
: 高pI（>9)
: 已知蛋白A跟蛋白B，或者蛋白B+C有相互作用
: 于是共表达然后纯化复合物
: 纯化过程中用detergent啊，lyzosome啊
: DNase还有RNase啊
: 结果破碎细胞以后离心得到的pellet，还有得到的复合物pellet都超级难resuspend的
: 一整块像Jelly的东西
: 能弄成大小碎块但是没有办法混匀
: 用针头反复吸吹也不行
|
s********n
发帖数: 2939 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 35 150 mM - 300 mM
【在 s********n 的大作中提到】
: 你的buffer里NaCl浓度是多少？
|
s********n
发帖数: 2939 | 36 只是猜测：你这种情况可能像ls有人提到的，形成A-B active complex比较复杂，或者
不稳定，易形成aggregation。可以试试，
1）in vitro reconstitution, 用很低的浓度做试验（ug/ml）；A和B在高盐浓度下的
稳定性如何？如果稳定的话，你可以试试在高盐（1 M even higher）条件下做混合，
高盐可能可以降低non-specific interaction形成aggregation的几率；
2）in vivo，你可以试试用weak promoters表达你的蛋白（Aw+Bw, Aw+Bm, Am+Bw; w,
weak, m, medium），lower temperature，coexpress chaparones。
不过个人更倾向于试in vitro的方法，in vivo的local concentration太高了即使在
low expression的条件下。
BTW: Chaperone的plasmid可以买Takara (Clontech)和Agilent (Stratagene).
【在 C*******e 的大作中提到】
: 150 mM - 300 mM
|
C*******e
发帖数: 4348 | 37 谢谢
我其实上周刚刚试了Takara家的一套5个chaperon plasmids
很可惜
因为用chaperon plasmid不能用codon plus或者rossetta strain
A蛋白完全没有表达
（WB探测不到；以前已经知道A有好几对tandem、甚至triple rare codon，需要codon
plus才能overexpression）
所以现在需要codon optimized ORF才行
还会继续试的
我想问问，如果说in vitro, low concentration试验的话
用什么手段检测/定性复合物呢
,
【在 s********n 的大作中提到】
: 只是猜测：你这种情况可能像ls有人提到的，形成A-B active complex比较复杂，或者
: 不稳定，易形成aggregation。可以试试，
: 1）in vitro reconstitution, 用很低的浓度做试验（ug/ml）；A和B在高盐浓度下的
: 稳定性如何？如果稳定的话，你可以试试在高盐（1 M even higher）条件下做混合，
: 高盐可能可以降低non-specific interaction形成aggregation的几率；
: 2）in vivo，你可以试试用weak promoters表达你的蛋白（Aw+Bw, Aw+Bm, Am+Bw; w,
: weak, m, medium），lower temperature，coexpress chaparones。
: 不过个人更倾向于试in vitro的方法，in vivo的local concentration太高了即使在
: low expression的条件下。
: BTW: Chaperone的plasmid可以买Takara (Clontech)和Agilent (Stratagene).
|
s********n
发帖数: 2939 | 38 你试试Agilent的ActicExpress (DE3) cell，这是用Gentamicin作为selection maker
，chaperone是来源于psychrophiles。
至于in vitro constitution，你也可以试试low temperature，low concentration
and high salt，low T可以减少aggregation的几率。检测最优当然是活性，不然就是
native gel/SEC/DLS。
codon
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 我其实上周刚刚试了Takara家的一套5个chaperon plasmids
: 很可惜
: 因为用chaperon plasmid不能用codon plus或者rossetta strain
: A蛋白完全没有表达
: （WB探测不到；以前已经知道A有好几对tandem、甚至triple rare codon，需要codon
: plus才能overexpression）
: 所以现在需要codon optimized ORF才行
: 还会继续试的
: 我想问问，如果说in vitro, low concentration试验的话
|
C*******e
发帖数: 4348 | 39 不知道是不是我没能理解
检测的话A和B都不是酶，没有活性可以检测
然后A是high pI，B是正常pI，跑普通native gel A是不行的
跑酸性native gel A太大，根本不跑进去；B又不能跑酸性的
还跑过Agarose Gel，加样孔在中间，可是也不理想
然后如果low concentration的话，又如何保证SEC能够检测到？
蛋白A本身在260、280的吸收就不好
EC的话只有0.4
是不是只有DLS一条途径？
maker
【在 s********n 的大作中提到】
: 你试试Agilent的ActicExpress (DE3) cell，这是用Gentamicin作为selection maker
: ，chaperone是来源于psychrophiles。
: 至于in vitro constitution，你也可以试试low temperature，low concentration
: and high salt，low T可以减少aggregation的几率。检测最优当然是活性，不然就是
: native gel/SEC/DLS。
:
: codon
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s********n
发帖数: 2939 | 40 Blue Native gel可行否？
如果你试了低浓度混合没有发现明显沉淀的话，你可以进一步用ultrafiltration浓缩
一下，但具体能浓缩到什么程度就不知道了，你得trial and error一番。
A和B是用同一种purification tag吗？如果不同的话，你可以试试在混合后纯化那个比
例少的，假如AB complex比较稳定的话。
DLS也需要一定浓度才能准确，如果浓度太低可能不一定准确。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 不知道是不是我没能理解
: 检测的话A和B都不是酶，没有活性可以检测
: 然后A是high pI，B是正常pI，跑普通native gel A是不行的
: 跑酸性native gel A太大，根本不跑进去；B又不能跑酸性的
: 还跑过Agarose Gel，加样孔在中间，可是也不理想
: 然后如果low concentration的话，又如何保证SEC能够检测到？
: 蛋白A本身在260、280的吸收就不好
: EC的话只有0.4
: 是不是只有DLS一条途径？
:
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i*****g
发帖数: 11893 | 41 如果楼主的博士论文就是这个，还可以继续
否则，我建议试验3个月，就投降，赶紧换下一个project
蛋白的东西，你折腾两年都不一定有结果，这里面的东西很烦的。
我3年前也搞过一个蛋白
我做了deletion，表达了30%，依旧很困难。样子和楼主描述的那个很像，
8M urea完全可以溶，然后一路降低到2M 就形成牛奶的乳白液，过夜就沉淀下来, self
-aagregation。始终很难获取solution
功能么，当然有很显著的功能，文献报告很明确。但就是搞不定
我仔细查了资料，想了半个月，我猜测，这种self-aggregation状态，和那种显著的功
能，恐怕有微妙的关系。
到这个份上，我就缴枪了，没时间耗得起。如果，我永远有钱有家产不在乎结果，我可
以花5年翻来覆去，所有现有办法都折腾一遍这个蛋白。 |
k******0
发帖数: 1073 | 42 试过不同表达体系没有？很多蛋白质在大肠杆菌里不能正确折叠。
self
【在 i*****g 的大作中提到】
: 如果楼主的博士论文就是这个，还可以继续
: 否则，我建议试验3个月，就投降，赶紧换下一个project
: 蛋白的东西，你折腾两年都不一定有结果，这里面的东西很烦的。
: 我3年前也搞过一个蛋白
: 我做了deletion，表达了30%，依旧很困难。样子和楼主描述的那个很像，
: 8M urea完全可以溶，然后一路降低到2M 就形成牛奶的乳白液，过夜就沉淀下来, self
: -aagregation。始终很难获取solution
: 功能么，当然有很显著的功能，文献报告很明确。但就是搞不定
: 我仔细查了资料，想了半个月，我猜测，这种self-aggregation状态，和那种显著的功
: 能，恐怕有微妙的关系。
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i*****g
发帖数: 11893 | 43 没机会折腾这些。
查过文献，那个就是棒状的直线结构，还非常high pI，还非常疏水
说不定，和楼主弄的是一个蛋白（不同的研究理由），嘿
【在 k******0 的大作中提到】
: 试过不同表达体系没有？很多蛋白质在大肠杆菌里不能正确折叠。
:
: self
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k******0
发帖数: 1073 | 44 我的蛋白也是无序结构，折腾很久，总算搞出来了。
【在 i*****g 的大作中提到】
: 没机会折腾这些。
: 查过文献，那个就是棒状的直线结构，还非常high pI，还非常疏水
: 说不定，和楼主弄的是一个蛋白（不同的研究理由），嘿
|
i*****g
发帖数: 11893 | 45 这个还不错，算有结果了。
很多时候，耗不起，取决于不同的研究目的。不是每个人都可以对某个蛋白折腾上几年
的。
蛋白啊，唉，千人千面，千变万化。不像DNA 千人10面。
【在 k******0 的大作中提到】
: 我的蛋白也是无序结构，折腾很久，总算搞出来了。
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 我的蛋白不疏水
而且在没有B的情况下
挺可溶的
我折腾到30mg/ml的
所以应该不是同一个蛋白
而且文献里没有关于这个蛋白的任何结构描述
也没有功能描述
【在 i*****g 的大作中提到】
: 没机会折腾这些。
: 查过文献，那个就是棒状的直线结构，还非常high pI，还非常疏水
: 说不定，和楼主弄的是一个蛋白（不同的研究理由），嘿
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z******i
发帖数: 120 | 47 仔细看了一下你的问题，你说的这个分别都挺好，混起来就沉淀，很常见。并非奇葩。
1.A B 是一样的BUFFER 吗？ 不是的话，把A加到B的fuffer里有沉淀不？
2. 给A 和B 全加上SOLUBLE TAG, 比如 MBP 或者更强的 NUSA tag， 不相信你的蛋白
还会沉淀。结构是HELIX BUNDLE 吗？网上预测一下。
3. 蛋白结合DNA/RNA不？ DNAse RNAse 不能除去很彻底。 要用PEI 和 硫酸铵。 另外
，高PI 很容易结合DNA/RNA, 并且在有GST存在的情况下有假结合。这个说来话长。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我的蛋白不疏水
: 而且在没有B的情况下
: 挺可溶的
: 我折腾到30mg/ml的
: 所以应该不是同一个蛋白
: 而且文献里没有关于这个蛋白的任何结构描述
: 也没有功能描述
|
C*******e
发帖数: 4348 | 48 1.A到B的Buffer或者B到A的buffer，都没有问题；
2.A预测出来没有结构
非常flexible & extended
B不是helix bundle
3.B不结合DNA/RNA，不过A就没办法了，高pI；因为功能未知，所以不知道是不是会特
异性的结合DNA/RNA。能不能展开说说“要用PEI 和 硫酸铵”？
谢谢
【在 z******i 的大作中提到】
: 仔细看了一下你的问题，你说的这个分别都挺好，混起来就沉淀，很常见。并非奇葩。
: 1.A B 是一样的BUFFER 吗？ 不是的话，把A加到B的fuffer里有沉淀不？
: 2. 给A 和B 全加上SOLUBLE TAG, 比如 MBP 或者更强的 NUSA tag， 不相信你的蛋白
: 还会沉淀。结构是HELIX BUNDLE 吗？网上预测一下。
: 3. 蛋白结合DNA/RNA不？ DNAse RNAse 不能除去很彻底。 要用PEI 和 硫酸铵。 另外
: ，高PI 很容易结合DNA/RNA, 并且在有GST存在的情况下有假结合。这个说来话长。
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C*******e
发帖数: 4348 | 49 求不吝赐教你是怎么折腾出来的？
想借鉴+得到启发
【在 k******0 的大作中提到】
: 我的蛋白也是无序结构，折腾很久，总算搞出来了。
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z******i
发帖数: 120 | 50 看来楼主也是很费了一番功夫的。 俺也就很想能帮上忙。
1.你的A 蛋白是全长吗。不是的话，最好的办法就是加TAG. （最推荐的方法，目前你
还没有试过）
以俺经验，改变CONSTRUCT往往是最有效的。 试试改改。
2. BUFFER TEST 可以进一步做一下: 用CONCENTRATOR 把A.B 都浓缩一下，目的是要
FLOW THROUGH 的buffer。 然后用 A-B buffer ‘B－A BUFFER 再试试看。
3.PEI DNA/RNA， 然后硫酸铵沉淀蛋白，这样才能彻底去除 BOTH DNA/RNA 和 PEI。另
外你说的不知道结合不结合，可以看一下260/280 VALUE，很简单。不要用EB啥的，那
个不准，跟上样量有很大关系
【在 C*******e 的大作中提到】
: 1.A到B的Buffer或者B到A的buffer，都没有问题；
: 2.A预测出来没有结构
: 非常flexible & extended
: B不是helix bundle
: 3.B不结合DNA/RNA，不过A就没办法了，高pI；因为功能未知，所以不知道是不是会特
: 异性的结合DNA/RNA。能不能展开说说“要用PEI 和 硫酸铵”？
: 谢谢
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C*******e
发帖数: 4348 | 51 1.这个蛋白超长的，100kDa左右，我们试过全长，试过分不同“domain”；加N-his，
加C-his，加N-GST，加Strep－tag。这些都试过。然后做过GST-Tag的pull down，有拉
下来B蛋白
不太明白你说的最好的办法试加TAG是针对什么方面说的？
可溶性？这个蛋白本身就挺可溶的，是加了B才会沉淀
正确折叠？这个蛋白应该属于 intrinsically unstructural的那一类
表达？蛋白表达也不错
2.这个还没有试过，flow through的buffer跟配好的同一批buffer有什么不同之处啊
3.谢谢建议！你是说用PEI先沉淀DNA／RNA，然后硫酸铵沉淀蛋白是这样么
【在 z******i 的大作中提到】
: 看来楼主也是很费了一番功夫的。 俺也就很想能帮上忙。
: 1.你的A 蛋白是全长吗。不是的话，最好的办法就是加TAG. （最推荐的方法，目前你
: 还没有试过）
: 以俺经验，改变CONSTRUCT往往是最有效的。 试试改改。
: 2. BUFFER TEST 可以进一步做一下: 用CONCENTRATOR 把A.B 都浓缩一下，目的是要
: FLOW THROUGH 的buffer。 然后用 A-B buffer ‘B－A BUFFER 再试试看。
: 3.PEI DNA/RNA， 然后硫酸铵沉淀蛋白，这样才能彻底去除 BOTH DNA/RNA 和 PEI。另
: 外你说的不知道结合不结合，可以看一下260/280 VALUE，很简单。不要用EB啥的，那
: 个不准，跟上样量有很大关系
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z******i
发帖数: 120 | 52 楼主，你的这些TAG基本没什么用，除非你的蛋白非常小。能说一下你现在用的蛋白
DOMAIN多大吗。
GST 对小蛋白非常有用，但大点的就作用有限，有时候还有副作用（因为是DIMER有聚
集效应）。 由于是DOMAIN，很有可能暴露HYDROPHOBIC区域，造成AB蛋白假结合或者聚
集沉淀。但希望不是这样。既然有文章支持结合，那结合还是比较靠谱的。100KD 应该
还算可以，主要你的表达怎么样。
个人建议用MBP（较弱，首选） 或者NUSA,先让你的蛋白不沉淀了再说。另外试试统一
BUFFER， 你AB能用同一种BUFFER吗，如果能，试试吧。在选择CONSTRUCT的时候要仔细
一点比较好，省得后面遭罪。至少要做个2D的ALIGNMENT 和结构的大概预测，相信楼LZ
已经做了。不能打破二级结构是最起码的要求。另外你的蛋白是否正确折叠是个问题。
多做几个CONSTRUCT的备选，费不了多少时间的。
如果经常做蛋白的DYNAMIC，就会对这个对照非常敏感。这里面肯定是有很大不同的。
虽然不太认为是造成你问题的原因，但简单的试一试也无妨。
对，这是终极方法。
现在俺很关注您的这个问题，后续能否解决，希望LZ给通报一下。很有意思。也很想能
帮上LZ。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 53 非常感谢！你给的建议非常具体、可操作
不过我还是想问，你说的“先让你的蛋白不沉淀了再说”是指让A+B在一起不沉淀了再
说么？
因为A蛋白单独不沉淀啊，30mg/ml，我觉得这个数字来说的话怎么都不能算是不太可溶
的情况
那么MBP和NUSA提供的优势是什么呢？
A蛋白本身不是没有能正确折叠的问题
是intrinsically unstructured without it's binding/interaction partner
而这个partner是B
但是现在的测试条件下（不管是in vivo还是in vitro）可能A和B的selfassemble的条
件不对
直接变成了沉淀
LZ
【在 z******i 的大作中提到】
: 楼主，你的这些TAG基本没什么用，除非你的蛋白非常小。能说一下你现在用的蛋白
: DOMAIN多大吗。
: GST 对小蛋白非常有用，但大点的就作用有限，有时候还有副作用（因为是DIMER有聚
: 集效应）。 由于是DOMAIN，很有可能暴露HYDROPHOBIC区域，造成AB蛋白假结合或者聚
: 集沉淀。但希望不是这样。既然有文章支持结合，那结合还是比较靠谱的。100KD 应该
: 还算可以，主要你的表达怎么样。
: 个人建议用MBP（较弱，首选） 或者NUSA,先让你的蛋白不沉淀了再说。另外试试统一
: BUFFER， 你AB能用同一种BUFFER吗，如果能，试试吧。在选择CONSTRUCT的时候要仔细
: 一点比较好，省得后面遭罪。至少要做个2D的ALIGNMENT 和结构的大概预测，相信楼LZ
: 已经做了。不能打破二级结构是最起码的要求。另外你的蛋白是否正确折叠是个问题。
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e****s
发帖数: 1125 | 54 很有意思的课题啊，没遇见过类似的。
感觉LZ想提这个可溶的复合物会比较难。A有100kd应该是多个Domain，有没有想过，把
每个Domain单独表达提纯出来，看看哪个Domain造成这个现象，造成复合物Aggregrate
的Domain和结合B的Domain是不是同一个Domain? |
z******i
发帖数: 120 | 55 不过我还是想问，你说的“先让你的蛋白不沉淀了再说”是指让A+B在一起不沉淀了再
对，是这个意思。
所以，如果换CONSTRUCT的话，可能从根本上解决这个问题。 可能是蛋白DOMAIN的选择
或者DOMAIN边界选择的不好造成的。从个人经验来说，可能最终还要走这一步。只是大
家都普遍不愿意走。
MBP 通常对蛋白结构没有太大影响，MBP本身很容易在通常的BUFFER条件下FOLD的很好
单体，因此与GST相反，会“稀释”一下LOCAL的A+B 浓度（如果A B 结合的话），希望
可以使你的A+B可溶
NUSA可溶性更强，但对这个TAG研究的不多，可以试试。LZ先让你的蛋白A+B可溶了再说
，不然无法往下走。
所以回到那个建议，A的BOUNDARY 选的不对。 LZ如果不愿挑战全长的话。不妨重新设
计一下这个DOMAIN 的CONSTRUCT.
或者走另一端，选择更小的区域，如果能找到一个小段的PPT 和B结合，也是不错。 蛋
白小了，加上TAG就很好HANDLE.但这只能说是个妥协的方案。
另外您的A蛋白能测下CD 或者DLS吗。有SAXS 或者 NMR 简单扫一下就更好。 但这都比
较麻烦，不如从CONSTRUCT 下手更经济一点。加个TAG 或者多试两个CONSTRUCT，我想
也不是很费事吧。
仅供参考。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 56 有，按照序列的分析有分成大概3个“domain”
（可能说region更准确一点，因为结构未知）
也做过1,2,3,12,23,123这样分别表达纯化这样一系列的试验。。。。
Aggregrate
【在 e****s 的大作中提到】
: 很有意思的课题啊，没遇见过类似的。
: 感觉LZ想提这个可溶的复合物会比较难。A有100kd应该是多个Domain，有没有想过，把
: 每个Domain单独表达提纯出来，看看哪个Domain造成这个现象，造成复合物Aggregrate
: 的Domain和结合B的Domain是不是同一个Domain?
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C*******e
发帖数: 4348 | 57 非常感谢深入讨论！
其实我们现在正在准备做CD
另外有位前辈站内信给我建议
做peptide array先找出A跟B结合的位点
我在跟老板沟通，希望能够做这个试验
DLS倒是没有想过，我会考虑！
另外这个蛋白我是做过SAXS的
但是被称为“一点feature都没有！”
“完全没有折叠！”
“为什么非要研究这个蛋白！”
。。。。。
这样。。。。。
【在 z******i 的大作中提到】
: 不过我还是想问，你说的“先让你的蛋白不沉淀了再说”是指让A+B在一起不沉淀了再
: 对，是这个意思。
: 所以，如果换CONSTRUCT的话，可能从根本上解决这个问题。 可能是蛋白DOMAIN的选择
: 或者DOMAIN边界选择的不好造成的。从个人经验来说，可能最终还要走这一步。只是大
: 家都普遍不愿意走。
: MBP 通常对蛋白结构没有太大影响，MBP本身很容易在通常的BUFFER条件下FOLD的很好
: 单体，因此与GST相反，会“稀释”一下LOCAL的A+B 浓度（如果A B 结合的话），希望
: 可以使你的A+B可溶
: NUSA可溶性更强，但对这个TAG研究的不多，可以试试。LZ先让你的蛋白A+B可溶了再说
: ，不然无法往下走。
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