s*****a
发帖数: 59 | 1 His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？ |
b******n
发帖数: 4225 | 2 可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看
【在 s*****a 的大作中提到】
: His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
: purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
: 是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
: Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
: cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
: uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
: resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
: 是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？
|
m*******8
发帖数: 256 | 3
不做IP能用Ni-NTA拉下来吗？
【在 s*****a 的大作中提到】
: His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
: purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
: 是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
: Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
: cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
: uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
: resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
: 是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？
|
s*****a
发帖数: 59 | 4 忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
10mM Tris, pH7.8做binding.
我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊
【在 b******n 的大作中提到】
: 可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
: 如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
: 需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看
|
s*****a
发帖数: 59 | 5 还没做过这个control。但是不做IP背景会不会太多，导致更难bind?
【在 m*******8 的大作中提到】
:
: 不做IP能用Ni-NTA拉下来吗？
|
m*******8
发帖数: 256 | 6
Milliopore
你IP之后用SDS洗脱，会把antibody一起洗下来，这样继续和你的蛋白结合，掩盖
了his tag，这个解释合理否？
【在 s*****a 的大作中提到】
: 忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
: 10mM Tris, pH7.8做binding.
: 我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
: 把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
: 还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
: Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
: SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊
|
y****y
发帖数: 123 | 7 要做的完全一样啊
我现在没用IP直接用Ni纯化之后杂带超多所以打算加一个IP
IP之后准备直接用6Mguanidine洗脱不知道可行性怎么样 |
y****y
发帖数: 123 | 8 Urea了应该不会再结合了
据说tris会影响Ni结合
再有尿素时间长了pH会变化最好新配
【在 m*******8 的大作中提到】
:
: Milliopore
: 你IP之后用SDS洗脱，会把antibody一起洗下来，这样继续和你的蛋白结合，掩盖
: 了his tag，这个解释合理否？
|
m*******8
发帖数: 256 | 9
有些结合比较强的即使在UREA的环境中还是有结合的，所以最好在IP之前用Ni拉一下，
看到底是his tag本身的问题，还是IP之后的问题。
【在 y****y 的大作中提到】
: Urea了应该不会再结合了
: 据说tris会影响Ni结合
: 再有尿素时间长了pH会变化最好新配
|
p****y
发帖数: 95 | 10 why use phosphate buffer for His-tag, it will precipitate Ni2+ and your
beads won't bind your His-tag protein anymore |
|
|
b******n
发帖数: 4225 | 11 我们总是用phophate buffer纯化his-tag
没啥问题
phosphate buffer的pH随温度变化没有tris大，也就是pH更稳定
【在 p****y 的大作中提到】
: why use phosphate buffer for His-tag, it will precipitate Ni2+ and your
: beads won't bind your His-tag protein anymore
|
b******n
发帖数: 4225 | 12 你把跟Ni2+ bead结合之后wash的条件也写出来看看
Milliopore
【在 s*****a 的大作中提到】
: 忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
: 10mM Tris, pH7.8做binding.
: 我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
: 把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
: 还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
: Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
: SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊
|
m*******8
发帖数: 256 | 13
你蛋白的最后用途是什么？
【在 y****y 的大作中提到】
: 要做的完全一样啊
: 我现在没用IP直接用Ni纯化之后杂带超多所以打算加一个IP
: IP之后准备直接用6Mguanidine洗脱不知道可行性怎么样
|
k****l
发帖数: 279 | 14 有可能你的蛋白 his-tag 已经被降解掉了
可以做Western看看，但是要注意千分之一的蛋白有tag，western也会有信号，所以要
和另一个 his-tag 蛋白比较一下强度
threshold?
bead)？
【在 s*****a 的大作中提到】
: His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
: purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
: 是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
: Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
: cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
: uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
: resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
: 是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？
|
y****y
发帖数: 123 | 15 mass
【在 m*******8 的大作中提到】
:
: 你蛋白的最后用途是什么？
|
a****n
发帖数: 79 | 16 低浓度蛋白的His纯化之前用IP(antibody)浓缩? 在本身就很杂的细胞extract中增加蛋
白不是好的开始,比较routine的办法用离子交换树脂(Ion exchange)浓缩后脱盐再过
His柱,根据结果再继续纯化.前面的步骤不要加任何SDS,SDS不可能靠脱盐就能洗脱的,
会严重干扰后续纯化,最后也很难复性. |
m*******8
发帖数: 256 | 17
看样子LZ是想找相互作用蛋白，不是想得到纯的蛋白。
【在 a****n 的大作中提到】
: 低浓度蛋白的His纯化之前用IP(antibody)浓缩? 在本身就很杂的细胞extract中增加蛋
: 白不是好的开始,比较routine的办法用离子交换树脂(Ion exchange)浓缩后脱盐再过
: His柱,根据结果再继续纯化.前面的步骤不要加任何SDS,SDS不可能靠脱盐就能洗脱的,
: 会严重干扰后续纯化,最后也很难复性.
|
