K**R
发帖数: 193 | 1 求助各位大侠两个问题，很着急，谢谢了！
1 我提取原代细胞后 加入5% DMSO 和medium 放入-80 冰箱过夜，在放入液氮，这样方
法对吗？应为样品及其宝贵
2 第二部有个逆转录载体质粒，我不想包装了，可以用普通lipofectamiane2000 等试
剂来转染吗？
效率一般是多少，
多谢大家了！ |
l***y
发帖数: 4671 | 2 要缓慢降温，1度／分钟。买个冻细胞用的IPA 罐子，或者自己用泡沫塑料盒子做一个。
【在 K**R 的大作中提到】
: 求助各位大侠两个问题，很着急，谢谢了！
: 1 我提取原代细胞后 加入5% DMSO 和medium 放入-80 冰箱过夜，在放入液氮，这样方
: 法对吗？应为样品及其宝贵
: 2 第二部有个逆转录载体质粒，我不想包装了，可以用普通lipofectamiane2000 等试
: 剂来转染吗？
: 效率一般是多少，
: 多谢大家了！
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C********4
发帖数: 308 | 3 怎么那么多实验室都没有细胞冻纯盒啊？很便宜的，一个几十美元，里面灌满异丙醇。
自制的不知道好用不。找个塑料盒子，里面内衬一层海绵，装满异丙醇，把冻存管放EP
试管架里，使试管架下部浸入异丙醇里，
那么珍贵的样品，不如买一个或者借一个冻存盒咯。细胞在冻存盒里面在－80度大于4
个小时，就可以转入液氮了。
最好用90%的血清＋10%的DMSO冻细胞，这样对细胞的保护作用最好，复苏后几乎没有死
细胞。
【在 K**R 的大作中提到】
: 求助各位大侠两个问题，很着急，谢谢了！
: 1 我提取原代细胞后 加入5% DMSO 和medium 放入-80 冰箱过夜，在放入液氮，这样方
: 法对吗？应为样品及其宝贵
: 2 第二部有个逆转录载体质粒，我不想包装了，可以用普通lipofectamiane2000 等试
: 剂来转染吗？
: 效率一般是多少，
: 多谢大家了！
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w********r
发帖数: 1431 | 4 primary cell难道不是要现用么？
冻起来再传几代谁知道里面变成什么样子了... |
C********4
发帖数: 308 | 5 可以冻存。
比如，李文辉乙肝受体的文章，树鼩原代肝细胞都是一次灌注出来，冻起来
慢慢用的。
每次都取原代，太麻烦了啊
【在 w********r 的大作中提到】
: primary cell难道不是要现用么？
: 冻起来再传几代谁知道里面变成什么样子了...
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s******s
发帖数: 13035 | 6 和我的做法一样，主要是懒，一种freezing medium全搞定。
这个其实还是取决于细胞，有的就算这么小心，化出来还是
大多数死掉，说不定直接-80还死的少点
EP
4
【在 C********4 的大作中提到】
: 怎么那么多实验室都没有细胞冻纯盒啊？很便宜的，一个几十美元，里面灌满异丙醇。
: 自制的不知道好用不。找个塑料盒子，里面内衬一层海绵，装满异丙醇，把冻存管放EP
: 试管架里，使试管架下部浸入异丙醇里，
: 那么珍贵的样品，不如买一个或者借一个冻存盒咯。细胞在冻存盒里面在－80度大于4
: 个小时，就可以转入液氮了。
: 最好用90%的血清＋10%的DMSO冻细胞，这样对细胞的保护作用最好，复苏后几乎没有死
: 细胞。
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K**R
发帖数: 193 | 7 谢谢你，好像我们有那种小方盒子。感谢！
个。
【在 l***y 的大作中提到】
: 要缓慢降温，1度／分钟。买个冻细胞用的IPA 罐子，或者自己用泡沫塑料盒子做一个。
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K**R
发帖数: 193 | 8 谢谢！
不知道你说的那个盒子是不是一个塑料小方盒子？ 您的方法很详细啊！ 对了你说90%
血清是全部FBS，还是DMEM +FBS？ 谢谢！
在 Cosimo2014 (柯希莫) 的大作中提到: 】
EP
4 |
K**R
发帖数: 193 | 9 是这样的，一次用不完，还要根据实验结果调整呢， 你说的是个问题，但是没办法只
有尝试
【在 w********r 的大作中提到】
: primary cell难道不是要现用么？
: 冻起来再传几代谁知道里面变成什么样子了...
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C********4
发帖数: 308 | 10 我喜欢用90%纯血清+10%DMSO
这样比掺杂了DMEM的对细胞的保护更好
【在 K**R 的大作中提到】
: 谢谢！
: 不知道你说的那个盒子是不是一个塑料小方盒子？ 您的方法很详细啊！ 对了你说90%
: 血清是全部FBS，还是DMEM +FBS？ 谢谢！
: 在 Cosimo2014 (柯希莫) 的大作中提到: 】
: EP
: 4
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j****x
发帖数: 1704 | 11 根据我个人的经验，人原代肝细胞一般还是不推荐冻存，质量会差很多，很多marker都
太不正常，用来做体外感染实验的话效率也会低很多。
不过最近有人向我推荐Karolinska Institute开发出来的一种新方法用于冻存人原代肝
细胞，我也准备近期试一下看看。
只是只是，发表的杂志太那个什么了。。。
http://www.wjgnet.com/1948-5182/full/v4/i5/176.htm
Improved cryopreservation of human hepatocytes using a new xeno free
cryoprotectant solution
另外一种可供参考的方法
http://www.springerprotocols.com/Pdf/doi/10.1007/978-1-59745-20
An Optimised Method for Cryopreservation of Human Hepatocytes
【在 C********4 的大作中提到】
: 可以冻存。
: 比如，李文辉乙肝受体的文章，树鼩原代肝细胞都是一次灌注出来，冻起来
: 慢慢用的。
: 每次都取原代，太麻烦了啊
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a******7
发帖数: 7936 | 12 没有冻存盒可以试试：
4度20分钟
-20度30分钟
-80度过夜
第二天放到液氮里
90-95%FBS+10-5%DMSO |
