S***6
发帖数: 431 | 1 Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是有没有方法解决这个问题？希
望能尽快得到插入全长的克隆。多谢！ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 PCR胶回收的？用的e.coli啥菌株？转化以后测了多少colony? 大的小的都挑了么？
的1
【在 S***6 的大作中提到】
: Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
: 一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
: 有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
: subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
: .3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
: recombination。
: 现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
: 插入的序列只有N端的大约1kb左右。
: 现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
: 组的序列。
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x**2
发帖数: 255 | |
m******5
发帖数: 1383 | 4 如果怀疑重组的话就用stbl3 cell line (invitrogen)
如果还不行就move on吧（换approach）
连接酶效率高是一方面
你用的高速kit里有PEG2000是另一个方面，不过这和重组没关系，只不过有毒性会降低
transformation efficiency. |
r****r
发帖数: 36 | 5 using yeast instead of E. coli to make the construct first then amplify the
plasmid by E. coli.
but u'll have to put yeast selection marker and replication origin into your
vector. |
l**********1
发帖数: 5204 | 6 LZ pls try
XL-TOPO@ zero blunt kit
3kbp < insert size < 10 kbp
//www.invitrogen.com/1/1/17320-topo-xl-pcr-cloning-kit.html
and
//www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/
Cloning/PCR-cloning.html
original hint was from
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31695611.html
3th floor |
