c*****n
发帖数: 233 | 1 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
建议。是不是5kb太大了，不容易成功？ |
X******n
发帖数: 914 | |
F*K
发帖数: 608 | 3 is there a place to buy whatever gene you want?
【在 X******n 的大作中提到】
: 为什么不直接去买呢？
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h**********r
发帖数: 671 | |
l*****i
发帖数: 1163 | 5 可以从openbiosystem买，或者harvard plasmid买 ，后者更便宜一点 。
Origene有几乎所有的基因，但是贵的离谱。
如果非要自己克隆，建议分段。
【在 c*****n 的大作中提到】
: 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
: 建议。是不是5kb太大了，不容易成功？
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s******s
发帖数: 13035 | 6 如果是人活着老鼠的基因，记得indiana u还是哪里有一个facility,
大多数都有，clone在pDown里面，好像也就$100一个
【在 c*****n 的大作中提到】
: 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
: 建议。是不是5kb太大了，不容易成功？
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c*****n
发帖数: 233 | |
s******s
发帖数: 13035 | 8 我觉得PCR不是问题，尤其是用phusion。可能copy number太少，
RT做的质量不高，所以全长模版莫有啊
【在 c*****n 的大作中提到】
: 是因为5kb太大吗？一般多大的要分段p
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c*****n
发帖数: 233 | 9 老板想要的isoform，网上没看到有现成的。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 可以从openbiosystem买，或者harvard plasmid买 ，后者更便宜一点 。
: Origene有几乎所有的基因，但是贵的离谱。
: 如果非要自己克隆，建议分段。
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c*****n
发帖数: 233 | 10 能发下网址吗？
【在 s******s 的大作中提到】
: 我觉得PCR不是问题，尤其是用phusion。可能copy number太少，
: RT做的质量不高，所以全长模版莫有啊
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c*****n
发帖数: 233 | 11 恩，实验技术不行啊。哎
【在 s******s 的大作中提到】
: 我觉得PCR不是问题，尤其是用phusion。可能copy number太少，
: RT做的质量不高，所以全长模版莫有啊
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c*****n
发帖数: 233 | |
s******s
发帖数: 13035 | |
c*****n
发帖数: 233 | |
s******s
发帖数: 13035 | 15 我记错了，是asu的
http://dnasu.asu.edu/DNASU/Home.jsp
你这个是果蝇的, 我以前做果蝇，所以记成indiana了
【在 c*****n 的大作中提到】
: https://dgrc.cgb.indiana.edu/
: 是这个吧？
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h******u
发帖数: 131 | 16 elongation time need 2min/kb. Did you keep you elongation time 10 min each
cycle? |
s******s
发帖数: 13035 | 17 taq 1min/kb, phusion 15sec/kb，不知道你说的啥酶
【在 h******u 的大作中提到】
: elongation time need 2min/kb. Did you keep you elongation time 10 min each
: cycle?
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a******c
发帖数: 597 | 18 这个好办。增大mRNA的量，逆转之后，换不同的high fidelity 酶，不同条件pcr，一
定能pcr出来。 我以前遇到过一模一样的问题。 |
c*****n
发帖数: 233 | 19 增大到多大算大。我的mRNA的浓度是差不多40ug/ml.
【在 a******c 的大作中提到】
: 这个好办。增大mRNA的量，逆转之后，换不同的high fidelity 酶，不同条件pcr，一
: 定能pcr出来。 我以前遇到过一模一样的问题。
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c*****n
发帖数: 233 | 20 你最后用的什么酶？
【在 a******c 的大作中提到】
: 这个好办。增大mRNA的量，逆转之后，换不同的high fidelity 酶，不同条件pcr，一
: 定能pcr出来。 我以前遇到过一模一样的问题。
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a******c
发帖数: 597 | 21 Takara PrimeStar polymerase.
【在 c*****n 的大作中提到】
: 你最后用的什么酶？
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c*****n
发帖数: 233 | 22 你的mRNA的浓度大约有多少？
【在 a******c 的大作中提到】
: Takara PrimeStar polymerase.
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a******c
发帖数: 597 | 23 Takara, prime star polymerase.
【在 c*****n 的大作中提到】
: 你最后用的什么酶？
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 RT用的什么酶？
我觉得RT的酶比下游PCR用的酶更重要
【在 c*****n 的大作中提到】
: 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
: 建议。是不是5kb太大了，不容易成功？
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h******u
发帖数: 131 | 25 pfu 2min/kb 是比较保险的。我扩过13KB的。条件是 26min elongation each cycle.
之前用16min each cycle 做过两次，都失败。 |
c****l
发帖数: 1086 | 26 Did you try nested pcr?
what do you mean by failure? could not detect it? |
s******s
发帖数: 13035 | 27 个人觉得pfu是个垃圾酶，高保真没问题，扩增效率太低，速度太慢。
我基本上认为phusion是最好的了，基本上clone都用这个，难办出不来
的换HiFi Taq试试运气，做screen的时候用homemade Taq
.
【在 h******u 的大作中提到】
: pfu 2min/kb 是比较保险的。我扩过13KB的。条件是 26min elongation each cycle.
: 之前用16min each cycle 做过两次，都失败。
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c*****n
发帖数: 233 | 28 yes, I tried. I can detect several low bands around 1.5kb-0.5kb. But those
are not my target.
【在 c****l 的大作中提到】
: Did you try nested pcr?
: what do you mean by failure? could not detect it?
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n********k
发帖数: 2818 | 29 a couple of questions:
1. Are you very experienced with molecular biology? no offense, u sounds a newbie to me...So a control question here: can you successful do other
short-ones say1-2kb or even less easily with the protocol...
2. do you know the exact sequence of the isoform(s), or you are trying to
use primers on the two extremes to fish out any possible isoforms(known or
unknow)?
3. With that, check your sequence complexity bioinformatic...anything
peculiar with your sequence?
4. if 1 and 2 is yes and 3 is no, then just go ahead to clone the guy with
the following approaches:
RT as usual--PCR 1-2kb fragments---fusion PCR with the proceeding PCR
products--cloning...
With good design, these can be done within 2-3 days...
5. last notes: for most of the cloning work(and many other experimentations too), there could be dozens of ways to achieve one's goal. Thus there is no point banging one's head against wall(stick to one approach unless for training purpose)...As well, 1-2 hrs/ days/months reading/careful thinkings sometimes could save days/months/ys work...BTW, when seeking help, it is always good to give a bit
details or enough information so that people could really know what's going on and where to start...otherwise it would be a crap-shoot and could be misleading...
【在 c*****n 的大作中提到】
: 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
: 建议。是不是5kb太大了，不容易成功？
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