B*********r
发帖数: 19 | 1 TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
接？
用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。 |
I***a
发帖数: 13467 | 2 3.5没有问题，
可以替代，
不用提高，
纯化肯定要好些， |
M********r
发帖数: 23 | 3 我做过3kb的，效率比2kb以下的要下降很多....
建议用takara的LA taq+GC rich buffer （I orII），这个高保真酶会自己加A的，所
以省一步效果很不错的。
【在 B*********r 的大作中提到】
: TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
: 接？
: 用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
: 等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
: 对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。
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r******y
发帖数: 21907 | 4 用invitrogen的XL TA kit
【在 B*********r 的大作中提到】
: TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
: 接？
: 用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
: 等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
: 对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 RE:
俺也参合一把
if GC rich >3kbp
first choice:
htp://www.clontech.com/FR/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR?sitex=10020:
22372:US#
htp://www.clontech.com/NO/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR/Long_PCR_and_GC
-Rich_PCR/Advantage_GC_2_DNA_Polymerase?sitex=10023:22372:US
then subcloning.
【在 r******y 的大作中提到】
: 用invitrogen的XL TA kit
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B*********r
发帖数: 19 | 6 感谢诸位的意见！
本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
是case by case了吧。
PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢
唉，看来还是干实验比较轻松愉快，湿实验太揪心了。。。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 7 RE:
not expensive blunt TOPO
but alternatively you can try
another ligation-anchored PCR protocol:
details just go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31517723.html
2F
from our experience even over 7.5kbp with a very longer 3' UTR mRNA (for
alternative splicing functions
possible) can be full cloned its ORF plus 5' UTR and near 3' UTR (3kbp)
then TA sub cloning
with TOPO TA kit:
htp://products.invitrogen.com/ivgn/product/K450001
Taq
【在 B*********r 的大作中提到】
: 感谢诸位的意见！
: 本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
: 是case by case了吧。
: PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
: 序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
: 之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
: 低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
: ，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
: 接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
: 了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢
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