b****r
发帖数: 17995 | 1 请大家推荐一下protocol或者哪个公司的kit吧，我已经被折腾了几个星期了还是扩不.我不是做
realtime，所以kit里不能含有sybrgreen
出来
网上搜到beckman coutler有个AmpliGrid Single Cell One-Step RT-PCR System，有
人用过吗？
还有invitrogen有个RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-PCR System |
r******y
发帖数: 21907 | 2 这里好像有人用qiagen的
不.我不是做
System
【在 b****r 的大作中提到】
: 请大家推荐一下protocol或者哪个公司的kit吧，我已经被折腾了几个星期了还是扩不.我不是做
: realtime，所以kit里不能含有sybrgreen
: 出来
: 网上搜到beckman coutler有个AmpliGrid Single Cell One-Step RT-PCR System，有
: 人用过吗？
: 还有invitrogen有个RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-PCR System
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M**a
发帖数: 4816 | 3 俺们实验室用Zymo microRNA kit.
不管是细菌还是动物细胞，做RT-PCR成功率是100%。
不.我不是做
System
【在 b****r 的大作中提到】
: 请大家推荐一下protocol或者哪个公司的kit吧，我已经被折腾了几个星期了还是扩不.我不是做
: realtime，所以kit里不能含有sybrgreen
: 出来
: 网上搜到beckman coutler有个AmpliGrid Single Cell One-Step RT-PCR System，有
: 人用过吗？
: 还有invitrogen有个RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-PCR System
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M**a
发帖数: 4816 | 4 sorry,I talked about the single cell level. |
b****r
发帖数: 17995 | 5 我就是说少量细胞，包括单个或者数个细胞
你用了这个kit提了RNA后进一步怎么做RT呢
【在 M**a 的大作中提到】
: sorry,I talked about the single cell level.
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O**U
发帖数: 72 | 6 ambion的cells to cDNA还行
不过不如直接用水+RNaseOUT把细胞破了来得快
反正我从来都是直接加水破细胞，用clonetech的EcoDRY逆转录，简单快捷
10个细胞以下很稳定
不.我不是做
System
【在 b****r 的大作中提到】
: 请大家推荐一下protocol或者哪个公司的kit吧，我已经被折腾了几个星期了还是扩不.我不是做
: realtime，所以kit里不能含有sybrgreen
: 出来
: 网上搜到beckman coutler有个AmpliGrid Single Cell One-Step RT-PCR System，有
: 人用过吗？
: 还有invitrogen有个RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-PCR System
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b****r
发帖数: 17995 | 7 你这个做了逆转录后用什么酶做PCR？ 大概多少个循环才行？要不要做nesting PCR呢？
【在 O**U 的大作中提到】
: ambion的cells to cDNA还行
: 不过不如直接用水+RNaseOUT把细胞破了来得快
: 反正我从来都是直接加水破细胞，用clonetech的EcoDRY逆转录，简单快捷
: 10个细胞以下很稳定
:
: 不.我不是做
: System
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s******s
发帖数: 13035 | 8 加dnase?
【在 O**U 的大作中提到】
: ambion的cells to cDNA还行
: 不过不如直接用水+RNaseOUT把细胞破了来得快
: 反正我从来都是直接加水破细胞，用clonetech的EcoDRY逆转录，简单快捷
: 10个细胞以下很稳定
:
: 不.我不是做
: System
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b****r
发帖数: 17995 | 9 楼上说的对啊，你这个不加DNAse吗？不加对后续有影响的可能，加了也可能影响接下
来的PCR，DNAse又不容易去掉吧
【在 O**U 的大作中提到】
: ambion的cells to cDNA还行
: 不过不如直接用水+RNaseOUT把细胞破了来得快
: 反正我从来都是直接加水破细胞，用clonetech的EcoDRY逆转录，简单快捷
: 10个细胞以下很稳定
:
: 不.我不是做
: System
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d****d
发帖数: 214 | 10 顺带问一下如何离心回收少量的细胞。
我也是要从少量的细胞中提RNA然后做qPCR。之前要做FACS staining 淋巴细胞, 然后
sort出大约1000个细胞在0.5ml的buffer中。所以提RNA前要将细胞沉淀。但因为细胞太
少，即使全部离心下来也不可见。所以想请问一下大家有什么高招可以确保细胞都离心
下来。
【在 b****r 的大作中提到】
: 我就是说少量细胞，包括单个或者数个细胞
: 你用了这个kit提了RNA后进一步怎么做RT呢
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a*******a
发帖数: 4233 | 11 少量细胞是多少？
以前用10个小鼠oocyte抽rna，用专门的微量rna 吸附柱kit
我在国内用天根，那么qiagen应该也有类似的
抽提过程加DNAse消化的,洗下来全部反转录到20ul体系
取1ul做realtime， gapdh ct大概17-18 |
a*******a
发帖数: 4233 | 12 能不能低温浓缩一下， 直接加lysis buffer。。
【在 d****d 的大作中提到】
: 顺带问一下如何离心回收少量的细胞。
: 我也是要从少量的细胞中提RNA然后做qPCR。之前要做FACS staining 淋巴细胞, 然后
: sort出大约1000个细胞在0.5ml的buffer中。所以提RNA前要将细胞沉淀。但因为细胞太
: 少，即使全部离心下来也不可见。所以想请问一下大家有什么高招可以确保细胞都离心
: 下来。
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b****r
发帖数: 17995 | 13 你这个方法似乎超强啊，17，8循环那都比得上普通RT了，难以置信
【在 a*******a 的大作中提到】
: 少量细胞是多少？
: 以前用10个小鼠oocyte抽rna，用专门的微量rna 吸附柱kit
: 我在国内用天根，那么qiagen应该也有类似的
: 抽提过程加DNAse消化的,洗下来全部反转录到20ul体系
: 取1ul做realtime， gapdh ct大概17-18
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a*******a
发帖数: 4233 | 14 我们反转录用的是toyobo的kit
一般1ug total RNA反转录到20ul体系里，取0.5ul做realtime
toyobo的realtime kit ct大概15+-0.3
18个cycle就又是10倍的浓度差了
而且我用的是卵细胞， 比较大mRNA也比较多
10个普通细胞肯定不会有这个效率的。
【在 b****r 的大作中提到】
: 你这个方法似乎超强啊，17，8循环那都比得上普通RT了，难以置信
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