X*******0
发帖数: 134 | 1 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
里,一点都没挂上.
由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9. | s*******e
发帖数: 1010 | 2 挺多的，1D4 tag或者FLAG tag都可以，就是有点贵。做没做WB鉴定一下flowthrough里
面的蛋白是不是带着His-tag的？表达期间降解掉就麻烦了。 | X*******0
发帖数: 134 | 3 做了,是带Tag的.你说的这些Tag,能解决问题吗?补充一下:我已经试了往蛋白C端和
HisTag之间塞了从4个一直到16个氨基酸长度的Tail或者说linker,还是不挂柱,我怀疑
我C端包在蛋白构象内部包得很深.你说的2种也是基于Tag的,会不会也有这样的Tag被包
的问题?能不能有不依靠Tag的,比如分子筛什么的有可行性吗?
【在 s*******e 的大作中提到】
: 挺多的，1D4 tag或者FLAG tag都可以，就是有点贵。做没做WB鉴定一下flowthrough里
: 面的蛋白是不是带着His-tag的？表达期间降解掉就麻烦了。
| s*******e
发帖数: 1010 | 4 如果你蛋白表达量还可以的话，不用tag纯化肯定是行的，无非是分子筛和离子交换轮
番上阵。可以先用两种离子交换粗分以下，最后用分子筛纯化。
但是如果是C末端包埋得太深的话，加了十六个氨基酸还被包埋了，肯定不是因为坑太
深的缘故，可能是你蛋白的某些区域和tag有特异性结合。换一种tag的话应该还有改善
。考虑到不用tag提纯实在太麻烦，你应该至少再试一种tag再考虑放弃亲和层析。我遇
到的一个蛋白就是C末端先连了一个Flag再放了一个His。结果用Ni完全提不出来，而用
Flag能出来不少。
【在 X*******0 的大作中提到】
: 做了,是带Tag的.你说的这些Tag,能解决问题吗?补充一下:我已经试了往蛋白C端和
: HisTag之间塞了从4个一直到16个氨基酸长度的Tail或者说linker,还是不挂柱,我怀疑
: 我C端包在蛋白构象内部包得很深.你说的2种也是基于Tag的,会不会也有这样的Tag被包
: 的问题?能不能有不依靠Tag的,比如分子筛什么的有可行性吗?
| s******y
发帖数: 28562 | 5 表达出来的蛋白可溶么？
如果可溶，可能你这个蛋白成二聚体或者多聚体什么的，然后正好把
his tag 档住了。
对于这种情况，用GST 正好。
【在 X*******0 的大作中提到】
: 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
: 里,一点都没挂上.
: 由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
: C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
: 那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
: ,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9.
| X*******0
发帖数: 134 | 6 可溶.可是结构和功能类似的酶,未见报道在正常情况下会形成多聚体的
【在 s******y 的大作中提到】
: 表达出来的蛋白可溶么？
: 如果可溶，可能你这个蛋白成二聚体或者多聚体什么的，然后正好把
: his tag 档住了。
: 对于这种情况，用GST 正好。
| X*******0
发帖数: 134 | 7 还有个可能会不会是我塞的tail有问题,我加的全是清一色的多聚甘氨酸,我是看中甘氨
酸小柔韧性好,不知这样的tail好不好,你们有没有什么建议的tail序列?
【在 s*******e 的大作中提到】
: 如果你蛋白表达量还可以的话，不用tag纯化肯定是行的，无非是分子筛和离子交换轮
: 番上阵。可以先用两种离子交换粗分以下，最后用分子筛纯化。
: 但是如果是C末端包埋得太深的话，加了十六个氨基酸还被包埋了，肯定不是因为坑太
: 深的缘故，可能是你蛋白的某些区域和tag有特异性结合。换一种tag的话应该还有改善
: 。考虑到不用tag提纯实在太麻烦，你应该至少再试一种tag再考虑放弃亲和层析。我遇
: 到的一个蛋白就是C末端先连了一个Flag再放了一个His。结果用Ni完全提不出来，而用
: Flag能出来不少。
| a**o
发帖数: 108 | 8 gsggs
【在 X*******0 的大作中提到】
: 还有个可能会不会是我塞的tail有问题,我加的全是清一色的多聚甘氨酸,我是看中甘氨
: 酸小柔韧性好,不知这样的tail好不好,你们有没有什么建议的tail序列?
| X*******0
发帖数: 134 | 9 是Gly-Ser-Gly-Gly-Ser? 可以循环4次搞个20AA的tail吗?
【在 a**o 的大作中提到】
: gsggs
| X*******0
发帖数: 134 | 10 还有,请教补塞tail的办法.我的基因是高GC的,本身就不好P,在引物上加tail造成长引
物更是扩增困难,tail越长越困难.如果能在质粒构建好能后补塞tail最好.有办法吗?
【在 a**o 的大作中提到】
: gsggs
| | | g*********r
发帖数: 9366 | 11 你这个很可能就是小Cterminal 掩埋，直接上GSTtag吧， 应该埋不了了
【在 X*******0 的大作中提到】
: 还有,请教补塞tail的办法.我的基因是高GC的,本身就不好P,在引物上加tail造成长引
: 物更是扩增困难,tail越长越困难.如果能在质粒构建好能后补塞tail最好.有办法吗?
| s*******e
发帖数: 1010 | 12 在你蛋白的C末端终止密码子之前加进两个限制性酶切位点，然后把你的补加的linker
和tag设计成引物。即使十六氨基酸加上十个His也就26×3=78个bp再加上两头的酶切位
点6×2=12和保护碱基四个，总共才不到100个碱基。设计两条长度60bp的引物在中间有
20bp的互补区域就正好能覆盖100个bp。放在一起退个火再延伸一个回合，把产物连到
你蛋白的C-末端就成了。
我觉得这个其实不是连多长的tail的问题，换tag可能更好。你可以连接一个GST或着
GFP到你蛋白的C末端，如果用GFP的话再把His连到GFP的C末端。这个融合蛋白如果能表
达就一定能亲和纯化。在两个蛋白之间加上一个蛋白酶切位点就有机会在纯化后切出你
的蛋白来。
另外，Hisx6已经不fashion了，要X8或者X10才能hold住场面！
【在 X*******0 的大作中提到】
: 还有,请教补塞tail的办法.我的基因是高GC的,本身就不好P,在引物上加tail造成长引
: 物更是扩增困难,tail越长越困难.如果能在质粒构建好能后补塞tail最好.有办法吗?
| c********b
发帖数: 363 | 13 可以试试NEB的Intein system,可以得到没有tag的蛋白.
另外,pI6.9, 你的buffer pH多少?不要太接近pI啊. 而且你用Tris buffer的话低温下pH不准(印象中是会变高).
为什么一定要pelB,是怕包涵体吗?如果是的话我可以给你一个protocol,基本上我试过
的蛋白都OK,而且保留活性,包括>100 Kd的T7 polymerase.
【在 X*******0 的大作中提到】
: 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
: 里,一点都没挂上.
: 由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
: C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
: 那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
: ,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9.
| C*********m
发帖数: 213 | 14 求protocol
下pH不准(印象中是会变高).
【在 c********b 的大作中提到】
: 可以试试NEB的Intein system,可以得到没有tag的蛋白.
: 另外,pI6.9, 你的buffer pH多少?不要太接近pI啊. 而且你用Tris buffer的话低温下pH不准(印象中是会变高).
: 为什么一定要pelB,是怕包涵体吗?如果是的话我可以给你一个protocol,基本上我试过
: 的蛋白都OK,而且保留活性,包括>100 Kd的T7 polymerase.
| C*********m
发帖数: 213 | 15
linker
His8 His10的真有那么好么？Qiagen的manual上说真正螯合Ni的也就是3个相间的His,
所以HQHQHQ tag有时候也挺好。His8 His10 在N-端会影响蛋白的表达和溶解度，在C端
会影响结晶。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 在你蛋白的C末端终止密码子之前加进两个限制性酶切位点，然后把你的补加的linker
: 和tag设计成引物。即使十六氨基酸加上十个His也就26×3=78个bp再加上两头的酶切位
: 点6×2=12和保护碱基四个，总共才不到100个碱基。设计两条长度60bp的引物在中间有
: 20bp的互补区域就正好能覆盖100个bp。放在一起退个火再延伸一个回合，把产物连到
: 你蛋白的C-末端就成了。
: 我觉得这个其实不是连多长的tail的问题，换tag可能更好。你可以连接一个GST或着
: GFP到你蛋白的C末端，如果用GFP的话再把His连到GFP的C末端。这个融合蛋白如果能表
: 达就一定能亲和纯化。在两个蛋白之间加上一个蛋白酶切位点就有机会在纯化后切出你
: 的蛋白来。
: 另外，Hisx6已经不fashion了，要X8或者X10才能hold住场面！
| s***m
发帖数: 6197 | 16 sunnyday说的很有可能
你的buffer是什么条件的
你看看PDB里这个3O8Y这个蛋白的结构
his tag刚好形成beta sheet稳定了dimmer的结构
可能是高盐的条件导致的
【在 X*******0 的大作中提到】
: 可溶.可是结构和功能类似的酶,未见报道在正常情况下会形成多聚体的
| l**n
发帖数: 109 | 17 也可以试一下Cu柱
如果NTA不行就试一下IDA柱
【在 X*******0 的大作中提到】
: 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
: 里,一点都没挂上.
: 由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
: C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
: 那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
: ,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9.
| X*******0
发帖数: 134 | 18 不带pelB的构建我试过,包涵体非常严重,SDS胶显示可溶部分几乎没有,全包涵了,甚至
在15度0.05mM IPTG这样的缓和条件下.另外,我注意到现在为止研究跟我的蛋白类似的
蛋白的文章,无一例外都用了pelB,大概这类蛋白本身就很不好溶.
6.9是计算出的理论pI,实际也许不同.buffer pH 8.
下pH不准(印象中是会变高).
【在 c********b 的大作中提到】
: 可以试试NEB的Intein system,可以得到没有tag的蛋白.
: 另外,pI6.9, 你的buffer pH多少?不要太接近pI啊. 而且你用Tris buffer的话低温下pH不准(印象中是会变高).
: 为什么一定要pelB,是怕包涵体吗?如果是的话我可以给你一个protocol,基本上我试过
: 的蛋白都OK,而且保留活性,包括>100 Kd的T7 polymerase.
| X*******0
发帖数: 134 | 19 我的buffer是sigma的Cellyic B.
【在 s***m 的大作中提到】
: sunnyday说的很有可能
: 你的buffer是什么条件的
: 你看看PDB里这个3O8Y这个蛋白的结构
: his tag刚好形成beta sheet稳定了dimmer的结构
: 可能是高盐的条件导致的
| s*******e
发帖数: 1010 | 20 Hisx10肯定不是灵丹妙药，我做的时候大概只有一半相对于Hisx6产率有所提高。螯合
金属当然不会有太多的His参与，但也有个His的局部浓度的问题。一个明显的例子就是
我有几个即使连着Hisx10的蛋白，咪唑梯度洗脱的时候也是先洗脱单体，再提高浓度才
洗脱二聚体。如果10和20个His有差别，我认为6和10有差别是必然的。
因为还没见过有副作用的例子，所以只好一律X10了。你说的影响溶解度的情况我还没
遇到过——His-tag影响溶解度是肯定的，但是没遇到过长短Histag影响的差别明显的
情况。
至于影响结晶，从来不敢带着Tag去长晶体，无论x6还是x10，一律切掉再说。
【在 C*********m 的大作中提到】
:
: linker
: His8 His10的真有那么好么？Qiagen的manual上说真正螯合Ni的也就是3个相间的His,
: 所以HQHQHQ tag有时候也挺好。His8 His10 在N-端会影响蛋白的表达和溶解度，在C端
: 会影响结晶。
| | | c********b
发帖数: 363 | 21 已经发了. 忘了说,我的方法对HIS tag或者Intein tag都适用.
【在 C*********m 的大作中提到】
: 求protocol
:
: 下pH不准(印象中是会变高).
| c********b
发帖数: 363 | 22 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
都没有问题.
Good luck.
【在 X*******0 的大作中提到】
: 不带pelB的构建我试过,包涵体非常严重,SDS胶显示可溶部分几乎没有,全包涵了,甚至
: 在15度0.05mM IPTG这样的缓和条件下.另外,我注意到现在为止研究跟我的蛋白类似的
: 蛋白的文章,无一例外都用了pelB,大概这类蛋白本身就很不好溶.
: 6.9是计算出的理论pI,实际也许不同.buffer pH 8.
:
: 下pH不准(印象中是会变高).
| j****x
发帖数: 1704 | 23 好方法还请贴出来大家共享嘛，不要站内啦，呵呵
assay,
【在 c********b 的大作中提到】
: 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
: 里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
: 来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
: 都没有问题.
: Good luck.
| o*****r
发帖数: 156 | 24 One thing you can check is to denature the protein (8M urea) to see if it
binds to the Ni column. If it does, the his-tag is buried and un-accessable
in the native state so you need a bigger tag/longer tail. If it still doesn'
t, something else is going on.
【在 X*******0 的大作中提到】
: 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
: 里,一点都没挂上.
: 由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
: C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
: 那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
: ,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9.
| X*******0
发帖数: 134 | 25 这是从已经形成的包涵体里提出native蛋白?有这么好的事可以发nature protocol了啊
assay,
【在 c********b 的大作中提到】
: 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
: 里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
: 来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
: 都没有问题.
: Good luck.
| p****p
发帖数: 3360 | 26 请问为什么说用GST正好。GST最后要切除不是也会有问题吗？
【在 s******y 的大作中提到】
: 表达出来的蛋白可溶么？
: 如果可溶，可能你这个蛋白成二聚体或者多聚体什么的，然后正好把
: his tag 档住了。
: 对于这种情况，用GST 正好。
| g*********r
发帖数: 9366 | 27 GST 个头很大， 不会轻易被挡住，
切除之后如果它应该成二聚，那就成二聚， 那不影响
【在 p****p 的大作中提到】
: 请问为什么说用GST正好。GST最后要切除不是也会有问题吗？
| s******y
发帖数: 28562 | 28 GST 本来就是二聚体，所以连上的蛋白如果也有成二聚体的倾向的话那不也就正好了么？
而且别人也指出了，GST个头大，不那么容易挡住。
【在 p****p 的大作中提到】
: 请问为什么说用GST正好。GST最后要切除不是也会有问题吗？
| p****p
发帖数: 3360 | 29 问题是如果his6的结论说明C末端是被包埋的，那么GST剪切不来的风险也不小啊。
除非linker加长。
么？
【在 s******y 的大作中提到】
: GST 本来就是二聚体，所以连上的蛋白如果也有成二聚体的倾向的话那不也就正好了么？
: 而且别人也指出了，GST个头大，不那么容易挡住。
| s******y
发帖数: 28562 | 30 除非要做结构，不然剪它干吗？
楼主好像是要做酶活的吧？
【在 p****p 的大作中提到】
: 问题是如果his6的结论说明C末端是被包埋的，那么GST剪切不来的风险也不小啊。
: 除非linker加长。
:
: 么？
| | | C*******e
发帖数: 4348 | 31 GST tag有C端的么？
lz的蛋白必须到periplasmic（N-pel signal）
你的意思是N-pel后面再连个可切的GST tag？
【在 s******y 的大作中提到】
: 表达出来的蛋白可溶么？
: 如果可溶，可能你这个蛋白成二聚体或者多聚体什么的，然后正好把
: his tag 档住了。
: 对于这种情况，用GST 正好。
| C*******e
发帖数: 4348 | 32 同求protocol
下pH不准(印象中是会变高).
【在 c********b 的大作中提到】
: 可以试试NEB的Intein system,可以得到没有tag的蛋白.
: 另外,pI6.9, 你的buffer pH多少?不要太接近pI啊. 而且你用Tris buffer的话低温下pH不准(印象中是会变高).
: 为什么一定要pelB,是怕包涵体吗?如果是的话我可以给你一个protocol,基本上我试过
: 的蛋白都OK,而且保留活性,包括>100 Kd的T7 polymerase.
| C*******e
发帖数: 4348 | 33 Pierce家也有buffer可以做这个的
我个人觉得一概的认为包涵体里就是变性的蛋白是不正确的
【在 X*******0 的大作中提到】
: 这是从已经形成的包涵体里提出native蛋白?有这么好的事可以发nature protocol了啊
:
: assay,
| s******y
发帖数: 28562 | 34 噢。我倒是没有注意到这一点！
C-terminal GST的确很少有人用，但在我的记忆中是可行的，只不过
因为公司卖的vector 大部分是放在N-terminal 的，大家都懒得去改而已
【在 C*******e 的大作中提到】
: GST tag有C端的么？
: lz的蛋白必须到periplasmic（N-pel signal）
: 你的意思是N-pel后面再连个可切的GST tag？
| c********b
发帖数: 363 | 35 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
Kd的酶).
我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
dilution的比例和体积.
Good luck. 用的高兴分我几个包子.
Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
- Culture the E. coli overnight
- Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
4hrs
- Pellet the E. coli at 6000 rpm at 4 degree
- Resuspend the pellet in 1 ml (per 100 ml bacterial culture) Native
lysis buffer (See
qiagen Ni NTA resin protocol for recipe), supply 1% SDS or Sarkosyl
- Sonicate with water bath sonication for 30 min at 4 degree (
sonication probe works
fine, just follow regular protocol, but be careful about bubble and heat)
- Add 100% Triton X100 to a final concentration 1% (~11 ul), and shake
O/N @ 4
degree
Note: 1) 2% Triton X100 (final concentration) is also fine here, may be
better.
2) may use detergent removal column to remove the detergent, but
not required.
- Dilute with Native lysis buffer 10 X (make SDS/ Triton concentration
0.1%), shake 5
min @ 4 degree
- Spin at 8000 rpm for 20 min, keep the supernant for subsequent assay
- Apply Ni NTA resin to the supernant. Incubate at 4 degree for at
least 1 hr with
shaking.
Follow the instructions from the manual for all the following steps.
Pray for good luck.
【在 j****x 的大作中提到】
: 好方法还请贴出来大家共享嘛，不要站内啦，呵呵
:
: assay,
| p****p
发帖数: 3360 | 36 你用的buffer pH有足够高么？
【在 X*******0 的大作中提到】
: 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
: 里,一点都没挂上.
: 由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
: C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
: 那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
: ,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9.
| x**x
发帖数: 92 | 37 非常感谢分享protocol, 看起来非常有道理， 我准备试试你的方法。
你的蛋白正常低温诱导也全在inclusion body么？
用了你的方法， 最终产量有多大，能有 mg per Liter 么？
另外，T7 RNA Polymerase 本身就非常可溶呀。低温诱导，正常Ni-NTA纯化，上次我做
了1升，提了20mg蛋白。
~
【在 c********b 的大作中提到】
: 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
: 再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
: 复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
: Kd的酶).
: 我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
: dilution的比例和体积.
: Good luck. 用的高兴分我几个包子.
: Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
: - Culture the E. coli overnight
: - Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
| c********b
发帖数: 363 | 38 我的主要蛋白(transcription factor，ribosomal protein, actin, etc)低温诱导也
主要在inclusion body里面（60%）。我现在什么蛋白都用这个法子，懒得试条件.
不同蛋白最后得到的终浓度不一样，但是基本都在mg以上。我一般做100ml,换算一下最
高的actin在25mg/l
【在 x**x 的大作中提到】
: 非常感谢分享protocol, 看起来非常有道理， 我准备试试你的方法。
: 你的蛋白正常低温诱导也全在inclusion body么？
: 用了你的方法， 最终产量有多大，能有 mg per Liter 么？
: 另外，T7 RNA Polymerase 本身就非常可溶呀。低温诱导，正常Ni-NTA纯化，上次我做
: 了1升，提了20mg蛋白。
:
: ~
| s********n
发帖数: 2939 | 39 Thanks for sharing!
你有没有比较过用这种方法提的蛋白和常规方法（soluble）提的蛋白活性上有无明显
不同？
【在 c********b 的大作中提到】
: 我的主要蛋白(transcription factor，ribosomal protein, actin, etc)低温诱导也
: 主要在inclusion body里面（60%）。我现在什么蛋白都用这个法子，懒得试条件.
: 不同蛋白最后得到的终浓度不一样，但是基本都在mg以上。我一般做100ml,换算一下最
: 高的actin在25mg/l
| c********b
发帖数: 363 | 40 做EMSA时Kd差不多。有个朋友拿去做kinase substrate,效果不错。别的就没经验了。
【在 s********n 的大作中提到】
: Thanks for sharing!
: 你有没有比较过用这种方法提的蛋白和常规方法（soluble）提的蛋白活性上有无明显
: 不同？
| | | m********i
发帖数: 64 | 41 Thanks, I will give it a try!
~
【在 c********b 的大作中提到】
: 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
: 再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
: 复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
: Kd的酶).
: 我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
: dilution的比例和体积.
: Good luck. 用的高兴分我几个包子.
: Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
: - Culture the E. coli overnight
: - Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
| s******y
发帖数: 28562 | 42 啊？ 你是说你连actin 都能用这个方法在细菌里面表达出来？
有活性么？能聚合么？能够和正常actin 一起聚合么？
如果以上答案都是"yes"的话，光是这个方法本身就可以写一个文章了。
我是认真的。
【在 c********b 的大作中提到】
: 我的主要蛋白(transcription factor，ribosomal protein, actin, etc)低温诱导也
: 主要在inclusion body里面（60%）。我现在什么蛋白都用这个法子，懒得试条件.
: 不同蛋白最后得到的终浓度不一样，但是基本都在mg以上。我一般做100ml,换算一下最
: 高的actin在25mg/l
| m******g
发帖数: 69 | 43 你的binding time是多少，建议4C overnight+ shaking | m******g
发帖数: 69 | 44 还有把BUFFER 的PH都调好，如果不是自己做的BUFFER,最后自己重新配BUFFER,然后调
PH | C*******e
发帖数: 4348 | 45 sonication需要半个小时的么
~
【在 c********b 的大作中提到】
: 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
: 再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
: 复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
: Kd的酶).
: 我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
: dilution的比例和体积.
: Good luck. 用的高兴分我几个包子.
: Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
: - Culture the E. coli overnight
: - Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
| c********b
发帖数: 363 | 46 你试过sanication water bath就知道效率有多低了。
如果用一般的probe, 2 min 应该就够了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: sonication需要半个小时的么
:
: ~
| c********b
发帖数: 363 | 47 actin是我的一个control所以没有花太多时间去研究。
我也是很痛苦提蛋白才摸索出这个方法的。我主要研究的蛋白是很经典的一个蛋白，表
达很难。我用的植物的基因因为codon bias就更难了。
我知道这个法子可能可以发个小methods，身边朋友试过也都告诉过我，无奈现在老板
没有兴趣，自己独立遥遥无期，加上实验室以前就没有做过蛋白生化，我也只是半路出
家的半吊子，这样投比较麻烦。再说一篇technical的小文章不会有太大用，自己也不想
花太多精力所以昨天犹豫了一下也就把方法贴出来了，能对研究有用才是最终目的。：）
最后说一下，蛋白还是很复杂，所以大家可以尝试一下。大多数情况应该是OK的，但是
肯定有不适用的，那就只能再摸索了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 啊？ 你是说你连actin 都能用这个方法在细菌里面表达出来？
: 有活性么？能聚合么？能够和正常actin 一起聚合么？
: 如果以上答案都是"yes"的话，光是这个方法本身就可以写一个文章了。
: 我是认真的。
| g*****y
发帖数: 6325 | 48 这个方法只适用于有tag 的蛋白吗？ 如果是用s/q-sepharose来纯化蛋白可以吗？
~
【在 c********b 的大作中提到】
: 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
: 再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
: 复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
: Kd的酶).
: 我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
: dilution的比例和体积.
: Good luck. 用的高兴分我几个包子.
: Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
: - Culture the E. coli overnight
: - Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
| c********b
发帖数: 363 | 49 我没有试过,不知道.你可以自己试一试.
理论上Triton X-100可以把蛋白上associate的SDS洗脱下来形成micelles,然后蛋白可
以得以复性.至于这样对sepharose柱子有什么影响我就不知道了.但是可以试试.
good luck
【在 g*****y 的大作中提到】
: 这个方法只适用于有tag 的蛋白吗？ 如果是用s/q-sepharose来纯化蛋白可以吗？
:
: ~
| h****6
发帖数: 229 | 50
【在 C*********m 的大作中提到】
: 求protocol
:
: 下pH不准(印象中是会变高).
| | | F******S
发帖数: 13 | 51 请问你用来resuspend pellet的native lysis buffer是怎么配的， QIAGEN的PROTOCOL
里面有0.3M NaCl， 你再加1% SDS 岂不是全都是沉淀。
assay,
【在 c********b 的大作中提到】
: 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
: 里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
: 来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
: 都没有问题.
: Good luck.
| h**********8
发帖数: 650 | 52 可否发我一份？
多谢！有 包子 哦。
美眉也是武汉人？
assay,
【在 c********b 的大作中提到】
: 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
: 里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
: 来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
: 都没有问题.
: Good luck.
| c********b
发帖数: 363 | 53 我是先resuspend之后再加的SDS，冰上放着没有看到沉淀。
PROTOCOL
【在 F******S 的大作中提到】
: 请问你用来resuspend pellet的native lysis buffer是怎么配的， QIAGEN的PROTOCOL
: 里面有0.3M NaCl， 你再加1% SDS 岂不是全都是沉淀。
:
: assay,
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