d****i
发帖数: 2346 | 1 要克隆一个promoter出来，但是从genomic DNA做模板怎么都PCR不出来，好几天非特异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
Taq也换了。很郁闷啊！
有经验的指点一下！谢谢了！ |
a********k
发帖数: 2273 | 2 买个含你需要的这个片段的BAC
异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
【在 d****i 的大作中提到】
: 要克隆一个promoter出来，但是从genomic DNA做模板怎么都PCR不出来，好几天非特异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
: Taq也换了。很郁闷啊！
: 有经验的指点一下！谢谢了！
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a*******a
发帖数: 4233 | 3 换一下酶和pcr程序试试，好像kod fx不错
我们实验室的标准protocol是
每p一个cycle+20s，30cycle，能放出若干大片段。
常规pcr无论如何放不出来。
不过promoter确实比较难 |
d****i
发帖数: 2346 | |
j****x
发帖数: 1704 | 5 promoter区的主要困难在于一般GC content都比较高，所以需要特殊的酶和buffer，这
个版上之前应该讨论过多次了，好几种候选。
BTW，转录起始位点上游1-2kb基本上就涵盖了绝大部分的TF binding sites了（当然特
例也有），所以一开始别太贪心，一上来就打算P个5kb什么的，那就没谱了。
此外，序列已知的话，直接合成序列也是一个办法，如果实在弄不出来 |
t*****z
发帖数: 1598 | 6 可以做nested PCR，先批出含有启动子的一段较宽的区域，然后把这个产物用作下一轮
的模板，来批出启动子本身。这样，就避免了启动子区域比较难批的困扰。 |
C*****h
发帖数: 926 | 7 先用几种restriction enzymes，把genomic DNA降解成小片断 (<100 kb)，
选择不降解你的promoter sequence的几种常用酶。
然后，用这个初步降解的genomic DNA作摸版，PCR你的promoter，
摸版的DNA量不要低于100 ng per reaction。
异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
【在 d****i 的大作中提到】
: 要克隆一个promoter出来，但是从genomic DNA做模板怎么都PCR不出来，好几天非特异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
: Taq也换了。很郁闷啊！
: 有经验的指点一下！谢谢了！
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d****i
发帖数: 2346 | |
l*******9
发帖数: 47 | |
d***y
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