s****2
发帖数: 19 | 1 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
带.
目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
的条带.
开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
带.
实在没有办法了, 重新设计了引物,产物也比原来长200bp.
悲催的是, 再次所有东西都换新的以后作PCR,负对照还是有条带,且比原来长200bp.
最后没有办法,都让实验室其他人帮我做,结果一样还是负对照有带.
今天老板让我不要自己再做了,找了专门作分子技师明天帮我做.
版上的各位高人,有人有过这么诡异的经历么,请赐教阿~~~ | i*e
发帖数: 352 | 2 一开始我猜也有可能是跑胶缓冲液太久没换的关系
不过你说新引物也相对应有200bp的诡异条带
难不成上样/跑胶时候漂移了？
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
| v***a
发帖数: 1242 | 3 真的很诡异……
帮顶一下
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
| s****2
发帖数: 19 | 4 开始也怀疑是缓冲液太久没有换,后来我就是每次跑胶都换新的缓冲液.
请问上样/跑胶的时候怎么能引起漂移呢?
【在 i*e 的大作中提到】
: 一开始我猜也有可能是跑胶缓冲液太久没换的关系
: 不过你说新引物也相对应有200bp的诡异条带
: 难不成上样/跑胶时候漂移了？
| s****2
发帖数: 19 | 5 谢谢帮顶~~~~
诡异到了极至.......又没有办法说跳过不做. 实验进程被耽搁了好久了.
郁闷的不是一点半点......
【在 v***a 的大作中提到】
: 真的很诡异……
: 帮顶一下
| b******n
发帖数: 4225 | 6 是啥基因?
如果是16s rDNA的话可能来自于空气中的DNA aerosol
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
| n*****e
发帖数: 119 | 7 是哦。这种问题不用说肯定要告诉大家目的片断是什么啊。如果是人类的，那么不戴手
套都可能是原因。的确是像aerosol。 | s****2
发帖数: 19 | 8 没有交代是什么基因的原因就是不是人或空气可能污染的.
目的基因是昆虫体节发育的调控基因. 我在后来设计引物的时候都blast过,确定引物对
不会和其他人类基因,甚至是virus有
binding扩增的可能性的.
【在 b******n 的大作中提到】
: 是啥基因?
: 如果是16s rDNA的话可能来自于空气中的DNA aerosol
| m*********n
发帖数: 215 | 9 你这是啥基因啊？ 有可能是你用的taq／pfu etc.等酶用来selection的基因。我们曾
经需要genotype Lacz，觉得总是污染，但是genotype其他基因都没问题。和楼主一样
所用东西都用新的之后还是不对。后来发现换了一种taq酶之后就好了。我们一致认为
是之前用的那一种taq用lacz筛选过。楼主可以换个公司的酶试试。 | s****2
发帖数: 19 | 10 奇怪就奇怪在之前克隆这个基因是完全没有问题的.以前也是用的同一公司的Gotaq和
Extaq....
【在 m*********n 的大作中提到】
: 你这是啥基因啊？ 有可能是你用的taq／pfu etc.等酶用来selection的基因。我们曾
: 经需要genotype Lacz，觉得总是污染，但是genotype其他基因都没问题。和楼主一样
: 所用东西都用新的之后还是不对。后来发现换了一种taq酶之后就好了。我们一致认为
: 是之前用的那一种taq用lacz筛选过。楼主可以换个公司的酶试试。
| | | z*******a
发帖数: 175 | | s****2
发帖数: 19 | 12 已经让在国内的闺密去替我烧香拜佛了.......
这两天准备相信上帝,不知道有没有帮助.......
您还有其他建议没?
【在 z*******a 的大作中提到】
: 中魔了
: 属science不可解决之超自然现象
| m*********n
发帖数: 215 | 13 那也先换个酶试试啊！
pfu, pfx
【在 s****2 的大作中提到】
: 奇怪就奇怪在之前克隆这个基因是完全没有问题的.以前也是用的同一公司的Gotaq和
: Extaq....
| b******n
发帖数: 4225 | 14 果蝇的么?
实验室的果蝇乱飞也有可能的,尤其是果蝇实验室
不知道你还有没有机会试试看
带着新订的引物干粉去别的实验室从头做,用他们的试剂(水，酶, dNTP啥的)
有时候aerosol很头痛的
增加特异性的话可以增长引物长度（比如由16-18bp增加到25bp以上）
这个措施是针对来源于Taq酶的污染（毕竟Taq酶很多来自于E. coli重组表达的，有细
菌DNA很正常）
【在 s****2 的大作中提到】
: 没有交代是什么基因的原因就是不是人或空气可能污染的.
: 目的基因是昆虫体节发育的调控基因. 我在后来设计引物的时候都blast过,确定引物对
: 不会和其他人类基因,甚至是virus有
: binding扩增的可能性的.
| b******n
发帖数: 4225 | 15 临时抱佛脚不行了
得神挡杀神，佛挡杀佛了
【在 s****2 的大作中提到】
: 已经让在国内的闺密去替我烧香拜佛了.......
: 这两天准备相信上帝,不知道有没有帮助.......
: 您还有其他建议没?
| z*******a
发帖数: 175 | 16 除了烧香拜佛信上帝
Quran要买一本， 麦加就不用去了，太废时废钱
钻研下scientism
对了，朱熹和王阳明的东西应该很醒脑
【在 s****2 的大作中提到】
: 已经让在国内的闺密去替我烧香拜佛了.......
: 这两天准备相信上帝,不知道有没有帮助.......
: 您还有其他建议没?
| s****2
发帖数: 19 | 17 上周五让我们lab另一间屋的人帮我做了. 我们的试剂是分开的.
结果是什么都没有,连用质粒,cDNA做模板的反应都没有任何产物.我守着人家加样的,没
有问题阿.
不知道是为什么.
只有明天再让人家帮忙做一次了.
【在 b******n 的大作中提到】
: 果蝇的么?
: 实验室的果蝇乱飞也有可能的,尤其是果蝇实验室
: 不知道你还有没有机会试试看
: 带着新订的引物干粉去别的实验室从头做,用他们的试剂(水，酶, dNTP啥的)
: 有时候aerosol很头痛的
: 增加特异性的话可以增长引物长度（比如由16-18bp增加到25bp以上）
: 这个措施是针对来源于Taq酶的污染（毕竟Taq酶很多来自于E. coli重组表达的，有细
: 菌DNA很正常）
| s****2
发帖数: 19 | 18 忘了说了,不是果蝇. 而且养虫子的实验室和我们分子实验室还离着有点距离的说
【在 b******n 的大作中提到】
: 果蝇的么?
: 实验室的果蝇乱飞也有可能的,尤其是果蝇实验室
: 不知道你还有没有机会试试看
: 带着新订的引物干粉去别的实验室从头做,用他们的试剂(水，酶, dNTP啥的)
: 有时候aerosol很头痛的
: 增加特异性的话可以增长引物长度（比如由16-18bp增加到25bp以上）
: 这个措施是针对来源于Taq酶的污染（毕竟Taq酶很多来自于E. coli重组表达的，有细
: 菌DNA很正常）
| s****2
发帖数: 19 | 19 好的,我明天就去给老板说订一个.....
谢谢~~~
【在 m*********n 的大作中提到】
: 那也先换个酶试试啊！
: pfu, pfx
| b******n
发帖数: 4225 | 20 呵呵，有意思了
为什么别人做的啥都没有，你做的啥都有呢？
明天你们再平行做一个实验
他加一组样，你加一组样
试剂都用同样的
看看啥结果
【在 s****2 的大作中提到】
: 上周五让我们lab另一间屋的人帮我做了. 我们的试剂是分开的.
: 结果是什么都没有,连用质粒,cDNA做模板的反应都没有任何产物.我守着人家加样的,没
: 有问题阿.
: 不知道是为什么.
: 只有明天再让人家帮忙做一次了.
| | | z*******a
发帖数: 175 | 21 我的做法
所有试剂换新maker，是与现用之不同maker，借用其他实验室枪，试管及所有用品
【在 s****2 的大作中提到】
: 好的,我明天就去给老板说订一个.....
: 谢谢~~~
| p*u
发帖数: 2978 | 22 换个bench试试？
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
| s****2
发帖数: 19 | 23 谢谢,您想的还真周到,也够跳跃的....
【在 z*******a 的大作中提到】
: 除了烧香拜佛信上帝
: Quran要买一本， 麦加就不用去了，太废时废钱
: 钻研下scientism
: 对了，朱熹和王阳明的东西应该很醒脑
| s****2
发帖数: 19 | 24 呜呜,您说我崩溃不......
【在 b******n 的大作中提到】
: 呵呵，有意思了
: 为什么别人做的啥都没有，你做的啥都有呢？
: 明天你们再平行做一个实验
: 他加一组样，你加一组样
: 试剂都用同样的
: 看看啥结果
| C*******e
发帖数: 4348 | 25 试试看带filter的tip
我觉得加样枪是不是有污染
【在 s****2 的大作中提到】
: 呜呜,您说我崩溃不......
| s****2
发帖数: 19 | 26 不怕您笑话,我都换了两三个bench了.......
一开始是怕我的bench不干净,因为我彻底清理之后,结果还是诡异.就借人家的地盘试试
.还是没用.
到后来就是为了换风水了........
【在 p*u 的大作中提到】
: 换个bench试试？
| s****2
发帖数: 19 | 27 一直作PCR就是用的有filter的. 后来为了排除tip被污染,都是做PCR之前拿盒新的开封.
我枪都按照说明洗过,也借别人的枪试过,一样结果诡异.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 试试看带filter的tip
: 我觉得加样枪是不是有污染
| C*******e
发帖数: 4348 | 28 拿新开封的东西换个实验室做：）
另外我以前也遇到过类似的事情
水做negative control也出目标条带
不过我同时有加模板的反应
应该是形成了气溶胶进去了
后来我老板跟我说要抓主要矛盾
要时刻记得自己要解决的问题是什么
如果这种细节问题对大局没有影响
不要太纠结
当然后来我做就超级小心
都是配好master mix以后分管
先加negative control的水
然后封上
然后再加别的管里的模板
这样就好多了
不过有的时候还是会有一点点信号
对了，你PCR做多少个cycle？
做15个，25个之类少一点cycle试试呢？
如果是污染会要比较多cycle才能出来
封.
【在 s****2 的大作中提到】
: 一直作PCR就是用的有filter的. 后来为了排除tip被污染,都是做PCR之前拿盒新的开封.
: 我枪都按照说明洗过,也借别人的枪试过,一样结果诡异.
| s****2
发帖数: 19 | 29 我就是因为之前的实验结果重复不出来,才检查之前构建的载体的.那成想会有怎么诡异
的结果.
这个很有可能就是我实验重复不出来的原因.要是这个问题不是问题,我也早就move on
了.
我开始想的也是那就不纠结直接构建的载体了.从头来过,到测序出结果,最多也就一周
的时间.但是,现在就是用新设计的引物
以水为模板做负对照也一样的有条带. 如果这个不解决的话,我之前的实验结果恐怕也
重复不出来了.
我开始也想有可能是气溶胶, 所有至少有两次,我是把有模板和没有模板的分看做的.
不管怎么说,也只能等到明天,找人帮我再试试了.
\
【在 C*******e 的大作中提到】
: 拿新开封的东西换个实验室做：）
: 另外我以前也遇到过类似的事情
: 水做negative control也出目标条带
: 不过我同时有加模板的反应
: 应该是形成了气溶胶进去了
: 后来我老板跟我说要抓主要矛盾
: 要时刻记得自己要解决的问题是什么
: 如果这种细节问题对大局没有影响
: 不要太纠结
: 当然后来我做就超级小心
| j****x
发帖数: 1704 | 30 把negative control的产物测个序，或者换到qPCR上看一下melting curve | | | s******y
发帖数: 28562 | 31 你应该看看你的两个引物是否有heterodimer
有些引物设计得不好的话，就互相overlap, 然后就一段一段的扩增起来了。
如果是这个问题，一个可以提高anealing temperature, 另外一个就是
重新设计引物。
另外，你们使用的pipet tip 有filter么？如果没有那就买有的
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
| c******r
发帖数: 3778 | 32 能写一下pcr的基本信息吗？
多少bp的product，primer的长度，annealing temperature，pcr的condition等等。
【在 s****2 的大作中提到】
: 最近实验不顺到了极至. 做basic PRC扩增一个基因, 只用水做模板也会有特异性的条
: 带.
: 目的基因是昆虫发育调控基因,在人体没有同源基因,我不会是污染源.
: 之前这个基因是扩增了且构建好载体的. 最近总是没有办法重复出来以前的结果,才想
: 着重新检查下基因表达的.结果,做PCR就是用水做负对照都会有和目的条带差不多大
: 的条带.
: 开始以为是被污染了.buffer, Extaq, dNTP 都换了新的,水也是用的新开封的
: commercial的ddH2o.结果用水作模板还是有一条漂亮的带.(也试了Gotaq,结果一样)
: 枪头肯定是新的,后来连枪都洗过了. 也重新去合成了之前那对引物,还是一样负对照有
: 带.
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