l***7
发帖数: 50 | 1 Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much! |
s******s
发帖数: 13035 | 2 保证你实验设计操作都没问题的情况下，会不会
你的蛋白比较稳定
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【在 l***7 的大作中提到】
: Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
: by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
: real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much!
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o**i
发帖数: 1165 | 3 我觉得你的realtime或者western有问题
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【在 l***7 的大作中提到】
: Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
: by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
: real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much!
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f*********e
发帖数: 1144 | 4 反着有可能，但是你的顺序不可能阿。。。。蛋白都行，怎么可能gene不行啊
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【在 l***7 的大作中提到】
: Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
: by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
: real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much!
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w*e
发帖数: 740 | 5 你确定抗体特异性很好么？
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【在 l***7 的大作中提到】
: Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
: by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
: real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much!
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w******y
发帖数: 8040 | 6 估计蛋白不特异
【在 f*********e 的大作中提到】
: 反着有可能，但是你的顺序不可能阿。。。。蛋白都行，怎么可能gene不行啊
:
: detected
: by
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f*********e
发帖数: 1144 | 7 什么意思？说抗体specificity差？
那打质普吧。。。。如果知道什么蛋白，一了白了
【在 w******y 的大作中提到】
: 估计蛋白不特异
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Z**********g
发帖数: 222 | 8 搞一个表达该基因的阳性细胞和不表达该基因的阴性细胞作为对照,确定一下PCR或
western是否出问题.另外,你的样品是否经过处理(如药物),比方说,可能该处理抑制了
mRNA表达,但该蛋白比较稳定,半衰期长. |
l***7
发帖数: 50 | 9 谢谢大家的回复。
我想要把人的FOXD３基因克隆到一个病毒载体上。看到有的公司用HEPG２细胞来检测他
们的抗FOXD３的抗体 （http://www.scbt.com/datasheet-133588-foxd3-f-23-antibody.html），我就用HEPG２细胞的cDNA来PCR FOXD３，总得不到所要的片段 （得到一片段，但大了１００多bp），即使是用real time pcr 的引物来检测cDNA，也没得到相应大小的片段。
有些细胞 (A-431, U-2 OS and U-251 MG) 检测不到FOXD３ RNA， 但能用FOXD３抗体
标记上，不知怎么解释。
RNA： http://www.proteinatlas.org/ENSG00000187140/rna
PROTEIN： http://www.proteinatlas.org/ENSG00000187140/cell
今天发现FOXD３只有一个外显子，没有内含子，所以我准备直接从基因组DNA里PCR试试。
谢谢。 |
l*****a
发帖数: 1431 | |
l***7
发帖数: 50 | 11 Yes, more than 70% GC. I have tried 10% DMSO or Enhancer Buffer from
Invitrogen for the PCR. |
l*****a
发帖数: 1431 | 12 10%DMSO 有点高了。你的PCR有positive control 或者说 在genomic DNA 上work吗？ |
l***7
发帖数: 50 | 13 用10%的DMSO是网上看到的，也有人用3%-8%的DMSO。
没有positive control。这基因GC含量很高，ORF含有72%的GC。我重新设计了一对不带
酶切位点（接头）的引物，今天刚从genomic DNA里扩出了一条大小相符的带。明天重
复一下，就送去测序看看。
谢谢。 |
