z****g
发帖数: 3340 | 1 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. | s******r
发帖数: 2876 | 2 你这个virus以前用过吗？肯定work吗？
人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望.
【在 z****g 的大作中提到】
: 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
: selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
: 有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望.
| z****g
发帖数: 3340 | 3 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好.
【在 s******r 的大作中提到】
: 你这个virus以前用过吗？肯定work吗？
:
: 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
: selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
: 有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望.
| l*****i
发帖数: 1163 | 4 想重编程？
嘿嘿，我貌似刚好听说过，如果感染之后传代，细胞不错。如果work，给我包子吧。
如果不work，只有建议你调整病毒滴度了。
【在 z****g 的大作中提到】
: 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
: selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
: 有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望.
| l*****i
发帖数: 1163 | 5 还有Puro不建议持续加，先加一天，然后长长，再加。
【在 z****g 的大作中提到】
: 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
: selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
: 有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望.
| z****g
发帖数: 3340 | 6 不是做iPS. 是想overexpression一个protein后看表型. 因为primary human
fibroblast难转染,就转了两次.
【在 l*****i 的大作中提到】
: 想重编程？
: 嘿嘿，我貌似刚好听说过，如果感染之后传代，细胞不错。如果work，给我包子吧。
: 如果不work，只有建议你调整病毒滴度了。
| l*****i
发帖数: 1163 | 7 上LV，通常都有现成的。滴度更高，转染效率更高，表达量更高。
或者用Amaxa的fibroblast转染kit也行。
【在 z****g 的大作中提到】
: 不是做iPS. 是想overexpression一个protein后看表型. 因为primary human
: fibroblast难转染,就转了两次.
| x********a
发帖数: 157 | 8 同问一下，你的“LV”指的具体是什么？我最近也有可能要做病毒转染，但一点经验都
没有。貌似你是这方面的行家。能不能具体说下哪些公司提供的哪些东西比较好用？我
的细胞是 SY5Y， 人肿瘤细胞，据说这种细胞不容易转染，所以要用病毒。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 上LV，通常都有现成的。滴度更高，转染效率更高，表达量更高。
: 或者用Amaxa的fibroblast转染kit也行。
| z****g
发帖数: 3340 | 9 LV应该是lentivirus。病毒感染除了primary cells 难做外，其他细胞系应该不难。
【在 x********a 的大作中提到】
: 同问一下，你的“LV”指的具体是什么？我最近也有可能要做病毒转染，但一点经验都
: 没有。貌似你是这方面的行家。能不能具体说下哪些公司提供的哪些东西比较好用？我
: 的细胞是 SY5Y， 人肿瘤细胞，据说这种细胞不容易转染，所以要用病毒。
| s******r
发帖数: 2876 | 10 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
不用加drug，感染后，western先看看。
以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好.
【在 z****g 的大作中提到】
: 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
: 到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
: 开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
: 另外,construct transient expression很好.
| z****g
发帖数: 3340 | 11 这个已经试过了，正常细胞感染表达都没问题。
【在 s******r 的大作中提到】
: 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
: 不用加drug，感染后，western先看看。
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: 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
: 到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
: 开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
: 另外,construct transient expression很好.
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