m******5
发帖数: 1383 | 1 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
端，于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／ |
g******1
发帖数: 244 | 2 不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。 |
o********r
发帖数: 775 | 3 以前有那种定点mutagenesis的protocol，用含mutation的primers和high fidality的
polymerase做linear amplification，然后用只切methylated DNA的RE处理，再
transformation。这样以后想怎么用都行。
现在不用这个protocol了？ |
g******1
发帖数: 244 | 4 他要加至少6个碱基进去，用mutagenesis恐怕不行吧 |
o********r
发帖数: 775 | 5 没必要6个全改吧。。。
【在 g******1 的大作中提到】
: 他要加至少6个碱基进去，用mutagenesis恐怕不行吧
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m******5
发帖数: 1383 | 6 这个我做过，但没在这么大的质粒上做过……
【在 o********r 的大作中提到】
: 以前有那种定点mutagenesis的protocol，用含mutation的primers和high fidality的
: polymerase做linear amplification，然后用只切methylated DNA的RE处理，再
: transformation。这样以后想怎么用都行。
: 现在不用这个protocol了？
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Not a good idea.
It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
restriction site.
【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
: 物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
: 端，于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
: 另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／
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o********r
发帖数: 775 | 8 这个和你想P出来原理基本上一样，差别是一个用E coli来扩增，一个用PCR，我还是相
信E coli多些
【在 m******5 的大作中提到】
: 这个我做过，但没在这么大的质粒上做过……
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n********k
发帖数: 2818 | 9 simply modify the vector first by fusion PCR (about anywhere 200bp-1kb)
introducing the desired cut site at
the desired position...and then do whatever you want...I would't trust any
PCR with a 13KB template without
sequencing...if u are luck, everything might be alright but u could end up
in dark having no clue what's gone
wrong...If you want to do the cloning in a single step which I won't
recommend if not an experienced one, just
go three piece or even four piece ligation... that way, u might just get
around the problem or introducing the
cut site and the insert at a same time...Anyway, the fact is in most if not
all scenarios, one could always find
alternative ways to do clonings.. I have yet run into any cloning I could
not come up with an alternative
strategy...and a last comment: sometimes detour is shortcut
【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
: 物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
: 端，于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
: 另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／
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f*******e
发帖数: 354 | 10 if he can insert MCS easily, he also can put his gene or some element into t
he single cut backbone.
i think the pcr protocol for such a big plasmid is not a good idea. why not
try enough enzyme digestion and dephosphate the backbone, in principle, 50%
ligation would be correct.
multiple
【在 s******y 的大作中提到】
: Not a good idea.
: It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
: restriction site.
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b******n
发帖数: 4225 | 11 我用PFU做过接近10k的质粒的点突变
取决于引物的设计和高效率的感受态
13k应该也可以吧
【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
: 物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
: 端，于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
: 另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／
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m******5
发帖数: 1383 | |
