n******u
发帖数: 418 | 1 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶，但是可
能是因
为里面含有genomic DNA的原因，会比较sticky，虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很
sticky，但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状，特别是大size的protein
，有人建
议我做一下sonication把genomic DNA震碎，我做了但是貌似不起作用，还有人建议我
treat
with DNase，但是我从来没做过，不知道这个会不会起作用，这里有没有人做过类似的
实验，如果
DNase treatment有作用的话，要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢？
如果这个方法也不行的话，请问还有什么别的办法可以解决smear的问题？
谢谢各位了！ |
f*********r
发帖数: 1233 | 2 这是个典型的例子，即便别人给了protocol，仍然不能重复。
几点建议：
1，DNase能不用就先不用。
2，loading buffer里先不要加bromophenol blue。或者不要加太多。至少要清亮，能
看到里面是透明还是混浊还是沉淀。
或者可以先用lysis buffer，处理完了再加浓缩的loading buffer。
3，pellet加上lysis buffer以后，不要用pipette打匀。而是直接用sonication冲击。
sonication是很强的，别说一个pellet，就是坚韧的大块骨骼肌组织，都能轻易打碎。
确认pellet被彻底打散并溶解了。
4，打碎以后离心，如果不理想可以考虑超高速离心。
5，取上清（这个时候应该一点都不粘了），加loading buffer，煮，跑胶。
6，如果条带形状扭曲，可以考虑把running buffer里面的tris含量酌情加量（2-3倍，
只要低分子量的蛋白仍然跑得开，跑不开的可以用4-20%的胶）。
7，如果还不太理想，可以考虑弃用glycin running buffer，改用taurin running
buffer。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 3 我没做过chromatin，所以说得不对的话请大家批评。
我主要是做recombinant protein expression比较多，在我用的protocol里，lysate
sonicate之后，高速离心之前的一个步骤就是加4%的PEI (polyethyleneimine)到终浓
度为0.2%左右。这一步就是为了去除DNA的，我做过gel shift，PEI处理过的蛋白跑的
胶确实没有DNA，而不经PEI处理的蛋白就会有DNA contamination，区别还是很明显的
。我的lysis buffer里没有加DNase，貌似PEI的效果就很好了。
但是不知道PEI对你的样品和后续处理有没有影响，所以只是作为参考。 |
m**z
发帖数: 787 | 4 PEI will precipitate the DNA and RNA, but it will precipitate the protein
associated with the nucleic acid as well. You can do this with 0.5 M or
higher NaCl, or wash the pellet afterwards, to decrease the protein-DNA
interaction, but some proteins will remain in the pellet.
In protein purification, this is a good step to get rid of nucleic acid, or
for purify a DNA binding proteins, etc...
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我没做过chromatin，所以说得不对的话请大家批评。
: 我主要是做recombinant protein expression比较多，在我用的protocol里，lysate
: sonicate之后，高速离心之前的一个步骤就是加4%的PEI (polyethyleneimine)到终浓
: 度为0.2%左右。这一步就是为了去除DNA的，我做过gel shift，PEI处理过的蛋白跑的
: 胶确实没有DNA，而不经PEI处理的蛋白就会有DNA contamination，区别还是很明显的
: 。我的lysis buffer里没有加DNase，貌似PEI的效果就很好了。
: 但是不知道PEI对你的样品和后续处理有没有影响，所以只是作为参考。
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c******r
发帖数: 3778 | 5 如果只是为了跑western，sonicate足够了。
你load了多少protein？sonicate多大的volume？在1.5ml管子里还是15ml管子？多长时
间？多少次？
要根据体积选用不同的头。如果体积太大，sonicate效果不好。如果体积太小，
sonicate很容易起泡泡。一旦起泡泡sonicate就没用了。
一般sonicate之后弹一下管子，以不粘稠可以自由流动为准。否则就再sonicate 20秒。
之后像ls说的，离心max speed 5min，取上清，95度10分钟，冷却，上样。
是很
protein
【在 n******u 的大作中提到】
: 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶，但是可
: 能是因
: 为里面含有genomic DNA的原因，会比较sticky，虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很
: sticky，但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状，特别是大size的protein
: ，有人建
: 议我做一下sonication把genomic DNA震碎，我做了但是貌似不起作用，还有人建议我
: treat
: with DNase，但是我从来没做过，不知道这个会不会起作用，这里有没有人做过类似的
: 实验，如果
: DNase treatment有作用的话，要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢？
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S*******m
发帖数: 34 | 6 可以试试先用适量的RIPA buffer提取蛋白，然后13000rpm离心，取上清。
是很
protein
【在 n******u 的大作中提到】
: 我直接把chromatin pellet用SDS loading buffer去boil几分钟然后用来跑胶，但是可
: 能是因
: 为里面含有genomic DNA的原因，会比较sticky，虽然跑SDS-PAGE胶的时候sample不是很
: sticky，但是跑出来之后做western发现整条lane城smear状，特别是大size的protein
: ，有人建
: 议我做一下sonication把genomic DNA震碎，我做了但是貌似不起作用，还有人建议我
: treat
: with DNase，但是我从来没做过，不知道这个会不会起作用，这里有没有人做过类似的
: 实验，如果
: DNase treatment有作用的话，要加多少量并且在什么条件下treat多长时间呢？
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W****C
发帖数: 1937 | |
