g*****n
发帖数: 241 | 1 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
火温度，结果要么是很多带，要么没有。
请问大家有没有什么建议？
谢谢！ |
Z******5
发帖数: 435 | 2 试一试touch down。 此外，做subclone可以考虑使用酶切。有时候不一定有直接的位
点可以使用，尝试一下有没有同尾酶或者用酶切之后补平等手段，总会有解决办法的。
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
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h****6
发帖数: 229 | 3 Can you synthesize the first 60 bp and make changes to the sequence to
change the GC/AT ratio for PCR? |
F******p
发帖数: 2099 | |
w********r
发帖数: 1431 | 5 对高GC的PCR，加1M betaine，dCTP/dGTP的量加倍，
然后DMSO 3-7% 和 退火温度一起，做一个二维的梯度试一下条件。
这个条件对付GC rich PCR，用了的都说好。
good luck!
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
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