a****d
发帖数: 1919 | 1 从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
I***a
发帖数: 13467 | 2 hot start 试一试，
变性温度提高点，
TAKALA 有个GC buffer2，
试一试 |
a****d
发帖数: 1919 | 3 谢谢楼上，用的就是TAKARA的GC buffer 2；目前试了53－58度的Tm，都没有特异条带。 |
s******r
发帖数: 2876 | 4 你先看看这个基因有没有的卖，用纯的plasmid作template容易一点。
在你可以考虑在atg之前寻找合适的primer，先得到PCR product
然后再PCR ORF。
roche有一个high gc的PCR kit，用过还行。
从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？
【在 a****d 的大作中提到】
: 从起始密码子开始，序列是这样的：
: ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
: gene本身65％GC含量,1.3Kb
: 打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
: pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
: without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
: 断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？
|
a****d
发帖数: 1919 | 5 多谢建议！
我试试在ATG之前找另一段primer
cDNA
【在 s******r 的大作中提到】
: 你先看看这个基因有没有的卖，用纯的plasmid作template容易一点。
: 在你可以考虑在atg之前寻找合适的primer，先得到PCR product
: 然后再PCR ORF。
: roche有一个high gc的PCR kit，用过还行。
:
: 从起始密码子开始，序列是这样的：
: ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
: gene本身65％GC含量,1.3Kb
: 打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
: pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
|
T*G
发帖数: 600 | 6 make a synthetic one if the purpose is to express a protein, keep AA same
while replace compatible
nucleotide from GC to AT
cDNA
【在 a****d 的大作中提到】
: 从起始密码子开始，序列是这样的：
: ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
: gene本身65％GC含量,1.3Kb
: 打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
: pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
: without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
: 断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？
|
a********k
发帖数: 2273 | 7 用Herculase II的cDNA扩增的条件，或者clontech的advantage 2
我忘记我克隆GC rich用的哪个了，后者PCR产物肯定非常多，不过突变率有点高
带。
【在 a****d 的大作中提到】
: 谢谢楼上，用的就是TAKARA的GC buffer 2；目前试了53－58度的Tm，都没有特异条带。
|
a****d
发帖数: 1919 | 8 Seems another way to get around with this problem. Thanks for your
suggestion!
【在 T*G 的大作中提到】
: make a synthetic one if the purpose is to express a protein, keep AA same
: while replace compatible
: nucleotide from GC to AT
:
: cDNA
|
m******e
发帖数: 18 | 9 Herculase II Fusion DNA Polymerases |
a****d
发帖数: 1919 | 10 Thanks for recommendation!
【在 m******e 的大作中提到】
: Herculase II Fusion DNA Polymerases
|
|
|
c*********r
发帖数: 1312 | 11 Phusion的polymerase很不错，有high GC content的buffer。 |
f********7
发帖数: 59 | 12 How about increase the Tm to 60-63C?
带。
【在 a****d 的大作中提到】
: 谢谢楼上，用的就是TAKARA的GC buffer 2；目前试了53－58度的Tm，都没有特异条带。
|
h***e
发帖数: 146 | 13 Primer 5 的 perfect不错的！！
退火温度至少60 |
a****d
发帖数: 1919 | |
K*o
发帖数: 96 | 15 这个基因有多大？如果不是很大，可以考虑直接合成。 |
k****l
发帖数: 279 | 16 For 1.3kb, it's cheap to synthesize. But it shouldn't be very difficult to
amplify. 24bp primer is too long, 18 is enough.
You can try epicentre fail-safe PCR kit. There are 12 buffers with different
Mg2+ and betaine combinations. Usually some of them should work. |
a****d
发帖数: 1919 | |
r*******w
发帖数: 127 | 18 首先可以在编码框之外的区域设计合适的引物，可以用基因组DNA作为对照模板（如果
没有内含子或者内含子区域不长）检测引物和该基因在cDNA pool的表达。
cDNA
【在 a****d 的大作中提到】
: 从起始密码子开始，序列是这样的：
: ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
: gene本身65％GC含量,1.3Kb
: 打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
: pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
: without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
: 断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？
|
z*******n
发帖数: 101 | |
a******n
发帖数: 167 | 20 嗯，支持DMSO。这么短的片段，加点DMSO应该work，也不怕多少突变。 |
|
|
n********k
发帖数: 2818 | 21 1. synthesis or any cDNA clones outthere...or just synthesis the little
piece and then fusion PCR to the entire piece...
2. Primers ahead of the region
3. Primers after this region but with this long tails and go with two
step PCR: 94 68, also try Primestar,
4. PCR small fragments and then fusion PCR...
5. PCR other regions and then add this little piece through PCR-
mutagenesis...
6. Get a bac/genome clone for this gene and PCR in small pieces and
then Fusion PCR, or just PCR this hard region a
【在 a****d 的大作中提到】
: 从起始密码子开始，序列是这样的：
: ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
: gene本身65％GC含量,1.3Kb
: 打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
: pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
: without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
: 断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？
|
a****d
发帖数: 1919 | 22 Thanks, buddy！
【在 n********k 的大作中提到】
: 1. synthesis or any cDNA clones outthere...or just synthesis the little
: piece and then fusion PCR to the entire piece...
: 2. Primers ahead of the region
: 3. Primers after this region but with this long tails and go with two
: step PCR: 94 68, also try Primestar,
: 4. PCR small fragments and then fusion PCR...
: 5. PCR other regions and then add this little piece through PCR-
: mutagenesis...
: 6. Get a bac/genome clone for this gene and PCR in small pieces and
: then Fusion PCR, or just PCR this hard region a
|
s********n
发帖数: 2939 | 23 0.5-2 M betaine and 1-10% DMSO. |
C*******e
发帖数: 4348 | 24 就提个醒哈
也许lz已经考虑过这个问题了
cDNA文库好不好？是不是自己准备的（或者可以信任的人准备的），做模板的时候有没
有加太多，加多了可能抑制PCR反应 |
a****d
发帖数: 1919 | 25 自己准备的cDNA文库，mRNA没有问题，qPCR可以detect到目的基因高表达；模板大概是
50－100ng/ul cDNA pool.
目前看来还是primer的GC比例过高了。
还要谢谢提醒
【在 C*******e 的大作中提到】
: 就提个醒哈
: 也许lz已经考虑过这个问题了
: cDNA文库好不好？是不是自己准备的（或者可以信任的人准备的），做模板的时候有没
: 有加太多，加多了可能抑制PCR反应
|
a*l
发帖数: 2685 | |
x******8
发帖数: 350 | |
g*********5
发帖数: 2533 | 28 you could clone part of this gene into plasmid first, then insert mutation. |
