l*******y
发帖数: 3987 | 1 赞倒三角！用aloe gel吧，你这还是出门度假被晒伤，偶更悲剧，在实验室切胶，被紫
外线晒伤了：（ |
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c******3
发帖数: 64 | 2 推荐太内急。拉打成功率比其他都高。弹性好。但不能搓球了。不转切易冒高以你的打
法。长脚拱完就一板。要想提高。就stop 搓球。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6 |
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b********l
发帖数: 707 | 3 我只是不想单独切出眼睛的照片，这样很假，别人还以为不是一个人呢：） |
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b********l
发帖数: 707 | 4 有人找我吵架，心情好我就奉陪啊，难道我钻被窝里哭切？ |
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p*e
发帖数: 6785 | 5 翻转完了，切一小块下来粘贴，再ps一下
有生之年混个院士当当。 |
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R****g
发帖数: 110 | 7 不是，我是原来DNA打碎后加的Adaptor的，然后用PE引物做了emulsion PCR，PCR产物
250bp切胶回收后又用PE引物
重新扩增。总之，用PE引物扩增的产物用E-gel和bioanalyzer检测的大小差100bp左右
。我现在想想可能是引物的问题，
原来illumina的引物我用完后就用invitrogen合成的，不知道illumina是不是把引物做
了修饰所以特别好用，或者和我自己
的引物序列都不一样。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 现在全部都改用SYBR Green和GelRed了，下游的操作和用EB一样，唯一的优点就是切胶
的可以不用紫外，既保护自己也保护DNA，但我都是严格按照EB的防护处理的，毕竟能
够和DNA结合的dyes，估计突变毒性不会小。 |
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y*******w
发帖数: 5917 | 9 SB楼主，莫非是唐俊亲友团？楼主这篇“打假”文章有几个硬伤，
1。Michigan State Univ虽说不是什么非常大的名校，但是至少可以算作二流，
2。JBC虽然每年文章量很大，但是基本上算是很严肃的杂志，
3。在过去切胶然后放在一起拍照是比较正常的，过去实验仪器一般，做个现在看似简单的试验需要很长时间。没有什么kit，经常发生control和试验结果并非同时结束的情况。
4。仔细观察的话，可以发现切割线其实并非完全垂直，如果是PS的话，何必搞一个非垂直的切割线？ |
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d*********n
发帖数: 10 | 10 强烈建议用 MO BIO Laboratories, Inc的UltraClean DNA purification Kit (Cat #
= 12100-300). 自从我摒弃QIAGEN的Kit,改用MO BIO的Kit以后，胶回收片段的回收率
一直很高很稳定(很强大)。我们实验室现在都在用这个KIT.
GOOD LUCK! |
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m*********s
发帖数: 1188 | 11 让俺先去学点东西才能看懂各位牛人的发言....
native gel electrophoreis,切胶回收...
mono S, mono Q,
谢谢. 做功课去先.. |
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O******e
发帖数: 4845 | 15 不用这么担心，就当是在外面晒了一下午太阳好了。
不过以后还是要穿长袖才好。一下子４０个constructs，够疯狂的。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 16 戴手套、穿长袖就行了，
照一次肯定没啥事的，不要常干这种事就好 |
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v***a
发帖数: 1242 | 18 回家用冰牛奶冷敷，牛奶越冰，敷的时间越久越好
我有一次还倒霉，当时太投入，并且也戴防护镜的，结果晚上回家roommate问我脸怎么
了，这么红。。。我晕死，着急得一晚上没睡好觉
第二天才用冰牛奶敷的，后来脸就黑了，再然后没感觉有什么异常，脸色也早已恢复。
不放心的话也可以去超市买点治晒伤的药。 |
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a*******e
发帖数: 245 | 19 我戴透明面罩，可惜这次穿的体恤，也忘了穿试验服了
thanks all again! |
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c******r
发帖数: 3778 | 20 哈哈，紫外线嘛，用sunscreen吧，不是有spf 70的吗？应该99.99%的紫外线都被block
掉了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 我有一次晚上做实验，第二天上课上的一半发现眼前渐渐模糊，
后来基本是半瞎，休息了半天才回复 |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 嗯，我今天把pfu和taq混一起跑了，跑出来了。然后切胶回收了。
谢谢。
的？ |
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i***a
发帖数: 11095 | 24 切胶纯化后的PCR产物作为模板的话，本来就很难成功
若是还不熟练的话，建议先将PCR产物先链接到现有的easy vector中扩增后
作为模板试试 |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 想做个nest PCR，但是在heterozygote 上面做，所以要切胶。。。
不过不需要很纯化的dna，实验室也没有kit或者各种相应工具，请问最简单的把几个
dna分子弄出来的方法是什么？够个pcr的就行了。多谢～ |
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s******r
发帖数: 2876 | 26 放到-20冻起来，然后融化，高速离心，取上清试试。
想做个nest PCR，但是在heterozygote 上面做，所以要切胶。。。
不过不需要很纯化的dna，实验室也没有kit或者各种相应工具，请问最简单的把几个
dna分子弄出来的方法是什么？够个pcr的就行了。多谢～ |
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w*****n
发帖数: 310 | 27 应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp
看不出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切
胶回收，（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。 |
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V********n
发帖数: 305 | 28 LZ最终目的不是要visualize band，然后切胶做mass spec.么？不是WB吧。pierce kit
似乎是WB用的。俺记得invitrogen有kit可以只洗脱蛋白，而不release antibody |
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k****l
发帖数: 279 | 29 理论上可以，但是难度比较大，主要是从胶里提取一般不纯，有agarose |
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f****n
发帖数: 114 | 31 我用的切胶回收 然后QIAquick Gel Extraction Kit |
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j****x
发帖数: 1704 | 32 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 33 没有做过，但是可以考虑这个策略：
用已知的这个序列做EMSA（non-radioactive），然后切胶，mass-spec. |
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s******s
发帖数: 13035 | 34 我都说了。这种东西太脏，拿去测出几十上百个蛋白你也不知道哪个是真的。
必须有好的control，然后并排SDS-PAGE，切胶去测 |
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f*********e
发帖数: 1144 | 35 我觉得兴趣是必备条件，但是远远不够资质的要求。资质应该至少具备，
1.是不是比大多数人聪明，比如你中学学理科的时候是不是不用上课，随便翻翻书，就
可以考高分。我很佩服原来高中版上一个女生，每天上课下课画漫画，但是竞赛总是最好
2.有没有宏观的调控能力，这个不是解个方程，我也不知道怎么阐述，言语太贫乏
3.又有敏锐的观察，对于微观的重要疑点一点也不放过
4.最初开始怎么也需要很好的动手能力吧，至少不能像我一样，作western都不敢切胶
，或者把焦片全部曝光。。。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 36 拿0.几ul产物太多了，0.几ul搞不好ug级别的模板
纯化一下稀释1000倍至10万倍做个梯度试试。
我们pcr有杂带以后切胶纯化目的片段重新pcr没问题的
goodluck |
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t*****z
发帖数: 1598 | 37 谢谢各位的提议！这两天我又做了一系列实验，试图提高两边都是原始引物的情况的扩
增效率，同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现：延长失活初始时间没用（
我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构）；延长延伸时间没用；增加模板
量有用（条带变深了）；增加反应循环数没用；降低温度没用（用的温度都高于理论Tm
）；增加镁离子没用（反而增加非特异扩增），改变缓冲液的种类没用（比如用Cl和用
SO4的）。我打算试试直接纯化和切胶回收。
大家的提议，我会陆续试试看！ |
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j****t
发帖数: 1663 | 38 我得到过和你差不多的size，有时略大些，average size is 300-350bp
因为上sequencer之前要作size selection （切胶纯化，200-400bp左右），所以我觉
得把DNA打到300bp左右应该还是可以测序的。
你不放心的话，可以先找个positive control region 来测一下你的ChIP DNA.再上
sequencer |
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j****t
发帖数: 1663 | 39 我得到过和你差不多的size，有时略大些，average size is 300-350bp
因为上sequencer之前要作size selection （切胶纯化，200-400bp左右），所以我觉
得把DNA打到300bp左右应该还是可以测序的。
你不放心的话，可以先找个positive control region 来测一下你的ChIP DNA.再上
sequencer |
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l*****i
发帖数: 1163 | 41 我自己的：从液氮罐取细胞时爆炸，鼻子破了，去医院包扎，很大一托。掰针药瓶的时
候玻璃扎破手，被老鼠咬，被针头戳
有个师弟拿了支细胞，说是炸弹，往水里一扔，结果真炸了。
有个师妹切胶时被紫外烧伤眼睛
要把一个大摇细菌的屋子改为办公室，用甲醛熏，结果墙壁有条缝，透到旁边实验室来
了。一个来面试的学生正在那里看文献。。。。。。后来老板收了她。
细胞间里的有紫外，有一次忘了关，把三做实验的照了半小时。有个师兄在Hood里忘了
关紫外，把细胞杀死了，结果还据此发了篇文章。
在Hood里点酒精灯，把酒精灯打翻了，酒精把整个Hood烧废了。从此灭火器成标配。 |
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l***g
发帖数: 19 | 42 想先做GST-pulldown，然后用pulldown产物电泳银染切胶回收去做MS。问题是，如果我
现在想用细菌中纯化的GST融合蛋白，应该bind多少蛋白到多少的beads上（100ul？）
，然后用HeLa细胞的裂解液来亲和吸附，应该大概用多少HeLa细胞裂解液？我感觉细胞
裂解液少了的话可能结合在GST融合蛋白上的蛋白太少了，在之后洗脱的过程中可能又
损失点，然后在银染的话可能看不出来。如果不用裂解液用动物组织，譬如rat或者
sheep的脑子，大概需要裂解多少克的脑子？多谢！ |
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d*******j
发帖数: 64 | 43 在你的一个引物5‘端加上M13序列，pcr后不要切胶回收，做个cleanup或者直接拿去测
序，测序引物用M13。
off
Qiagen |
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D******9
发帖数: 2665 | 45 请教一下， 我想做一个endogenous IP， 然后跑SDS-PAGE , coomassie blue染色后切
胶， 做MASS。
这个蛋白表达量不高， 需要用很多cells 然后IP， 估计得combine好几个IP后才能看
到带， 我用SDS-loading buffer 煮protein-antibody complex， 但是这样体积就太
大了， 没法load 到一个well， 有啥好办法解决这个问题？ 谢谢。 |
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y******g
发帖数: 3 | 46 小弟目前在做关于lncRNA的研究，在做race鉴定一些lncRNA的全长。遇到了一些问题。
求助各位高手。
我用目前的方法做出了2条全长以后，接下来怎么做都做不出来了。
我RACE完的产物每一次都能跑出很亮的1-1.5KB的条带，切胶回收连接到T载体以后测序
。发现序列都是错的，序列两端有制作模板时候加的接头序列，但是中间的片段在基因
组里都找不到，或是一些错的片段。我自己检查了引物，酶，DNTP，水都没有污染，也
不知道为什么会这样，求高手指点. |
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q*******8
发帖数: 768 | 47 上样太多了吧。。。我做切胶回收的时候都是这个样子的。。。。。。 |
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w********a
发帖数: 324 | 48 搭车问一个PCR的问题：
我用做完的PCR product，作为template，继续做PCR
，想得到更高浓度的产物；但总是不成功。要么干脆没有条带，要么有比较强的
unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
我试过用做完PCR的mixture直接作为template，也试过先clean-up一下，或者切胶纯化
一下，都不成功。不知道为什么？
非常感谢。
Scar
assembly
exonuclease |
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k****l
发帖数: 279 | 50 片段切胶纯化了吗？
连起来之后就能表达吗？如果是，怕蛋白对细菌有毒性 |
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