b*****o
发帖数: 150 | 1 Should be pretty easy. What's your mean "每次都连得稀奇古怪的"?
Is your 2000bp DNA fragment PCR product? or released from another vector?
Are KpnI and HindIII very close to each other? Provide more information if
you really want to get help |
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t*****z
发帖数: 1598 | 2 如题，有些啰嗦，诸位好心的看官如果课题紧张的话，只看题目就行啦。
我在做一个最最常规的把插入序列连接到载体里面的分子克隆实验。插入片段两边的酶
切位点是BamHI和XbaI，载体当中的酶切位点是BglII和KpnI。其中BamHI和BglII是匹配
的，可以连接，但是XbaI和KpnI不匹配。但是我为了赶时间，打算强行连接了。我注意
到KpnI是平端。我想先把XbaI用Klenow片段修平了，再连接到KpnI的平端上去。我的具
体实验设计如下：
把插入序列和载体用T4连接酶连接一段时间（连接BglII和BamHI末端），然后把T4连接
酶加热失活，然后加入Klenow片段（他们的缓冲液相互兼容），反应一段时间（把XbaI
末端补平），加热失活，再加入T4连接酶，反应更长的时间（把两个平端相连），最后
转化。
这个方案不知可行否？成功率大不大呢？可以做什么样的改进呢？
另外我对T4连接酶的效率比较好奇。以前读书的时候，都是连接过夜，至不济也要连接
四个小时。可是现在的T4连接酶的说明书上，都只要五分钟十分钟的，是现在的酶果真
都那么强吗？各位平时做连接都连接多久呢？
谢谢各位！ |
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p****p
发帖数: 3360 | 3 1. KpnI 不是bunt end。
2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
接。
XbaI |
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h**********r
发帖数: 671 | 4 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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b******r
发帖数: 111 | 5 Hi,everyone,
I have to use single restriction sites for insertion of multiple fragments
. When using KpnI site, just get one successful insertion from 70 clones.
For NotI, it is 1 from 4,BamHI is 1 from 2. My question is why the ligation
is so bad at KpnI site? Or other reasons? Thanks |
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C*I
发帖数: 4736 | 6 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 7 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 8 Published: 30 October 2013
Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the
ACE2 receptor
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu,
Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji
Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi
Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi
Nature volume 503, pages535–538(2013)Cite this article
Abstract
The 2002–3 pandemic caused by severe acute respirator... 阅读全帖 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 9 谢谢你的指点。KpnI那个是我自己搞错了。你的方法看起来更加可靠些。我来试试看吧。 |
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g*********r
发帖数: 59 | 10 Glad to hear that. I thought I might make some mistakes during midi prep.
I also notice that sequence provided by addgene is not right. I tried to cut
it with kpni.the bands I got differs from predict. |
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b******s
发帖数: 1089 | 11 实验室其他人遇到过经年的KpnI不work。但我自己切没遇到过问题。单酶切你可以上很
浓的质粒，多加点酶，但是不要超过反应体系的10%，过夜，加CIP，应该能做出来。
fragments
ligation |
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g***j
发帖数: 40861 | 12 怎么把一个2000 多的片段连到一个7000多的载体上，每次都连得稀奇古怪的？ |
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g***j
发帖数: 40861 | 13 是应该很简单啊
2000的片段是从别的质粒上消化下来的
两个酶切位点在载体上相距800吧
每回连出来的质粒都比消化过的载体还小，每回还都不一样。
我就奇了怪了。 |
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b*****o
发帖数: 150 | 14 我有一同事，从一个要来的载体上双切连一个片段，却怎么也连不上。一会认为酶有问
题，一会认为KIT有问题。我建议他首先搞清楚是不是还有其他的酶切位点，就是是否
是特异的一个切点。不要完全以来于提供载体人的信息。他分别切后，发现其中一个酶
有两个酶切位点，这个酶切出的片段大小和他用两个酶切出的是一样的。这说明这个酶
有一个位点在另外外一个酶位点里面，而且靠的很近。后来测序发现果然是这样。原理
做这个载体的人离开那个实验室，而后来的人根据他的NOTEBOOK做了个图，这个酶切位
点给漏掉了。也就是说他每次同时放两个酶同时切，其实最后两端是同一个酶切位点。
后来找了另外一个在最里面的酶做克隆，一次成功。
希望通过这个故事能解决你的问题。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 15 从别人那里要了点带flag标签的pcDNA3.1质粒，有map，看附件，插入的FLAG序列带
stop codon，是不是只能在KpnI上游插入target gene coding sequence了，而且
要把stop codon去掉？ |
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n****y
发帖数: 819 | 16 需要一个很简单的 cloning plasmid， 必须要有 KpnI 和 XhoI， 不能有 AvrII。 只
是用来做cloning 的， 不需要表达， 所以其他elements越少越好， 而且千万不能有
sv40 early promoter and origin， 因为里面有一个酶切位点之后会用到。 谢谢 |
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H*******i
发帖数: 196 | 17 Clone 一个pmb1（PUC）的origin+一个kan/clora的抗性，酶切位点选KpnI/XhoI
把基因插进去好了。。
一共两个/三个片段，太简单了。 |
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j******i
发帖数: 939 | 18 Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。 |
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