C*******e
发帖数: 4348 | 1 如题
Phusion Hot Start II和Herculase II该选哪个？
还是PCR的问题
Pfu Ultra II、Taq一开始都扩不出来
后来发现是模板的序列跟我们手上的序列不一致
现在根据测序结果设计了引物
Pfu Ultra II只有非特异产物出来
目的片段不算多大，4kb不到
GC含量也没有特别高，60%而已
一般的优化都试过了
现在老板支持买别的酶试试
大家说选哪个？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 不是长短的问题...
如果phusion hot start II和herculase II两个里面选一个呢？
选哪个
有哪位用过的xdjm来说说？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 这个酶有什么特别之处么？
去Invitrogen网站上查了，可没有强调对于high GC%或者难扩增的序列有什么优势
相反我要二选一的两个酶，Herculase II和Phusion Hot Start II至少是号称可以扩增
难扩的序
列的 |
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c**********6
发帖数: 1173 | 4 Herculase 和phusion比怎么样？
我做的Herculase的产量是最高的。当然啦，我的PCR的底物浓度很高的那种。 |
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m***o
发帖数: 272 | 5 找到知音了！我最近作很多PCR，用不同的酶，其中用clonetech家的GC2 polymerase的
时候少了一个exon，因为正好少的是一个exon，我就兴奋的以为发现了另外的剪切方式
，奶奶的，我都兴奋的通知老板了！后来一想不对劲，那个exon没了，会移码突变了。
后来我还是把它纯化了，想放到表达质粒去，因为量少，我就做了个nest pcr，用的
herculase 和GC2两个酶，结果呢，GC2又比herculase考出来的又小百把个bp，不问了
，我就放质粒去了，测出来呢，这回少了3个多exon，不过不是整个的exon了，所以我
就彻底断了继续下去的念头，还是老实的用原来的全序列了。这几天我正打算是不是跟
clonetech的客服联系，是不是可以给我点什么补偿呢？不过我确实觉得跟序列的二级
结构有关系，不知谁有这方面的文献。 |
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r****o
发帖数: 105 | 6 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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r****o
发帖数: 105 | 7 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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a********k
发帖数: 2273 | 8 Stratagene的Herculase II
在我手上比Invitrogen的platinum和pfx,neb的phusion要好
如果fidelity要求不是很高可以考虑clontech的advantage 2，产量绝对惊人 |
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a********k
发帖数: 2273 | 9 用Herculase II的cDNA扩增的条件，或者clontech的advantage 2
我忘记我克隆GC rich用的哪个了，后者PCR产物肯定非常多，不过突变率有点高
带。 |
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m******e
发帖数: 18 | 10 Herculase II Fusion DNA Polymerases |
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y****i
发帖数: 2194 | 11 Herculase from Stratagene,
great for long and high GC PCR |
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h******e
发帖数: 897 | 12 4kb的话用Platinum PCR Supermix (Invitrogen)应该没问题 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 Invitrogen Platium HIFI Taq |
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c**********6
发帖数: 1173 | 14 最近在做一些很简单的PCR。就是来amplify一些大概200mer的DNA library。
发现做完PCR以后总是会在管子里面发现好一些白色的沉淀。感觉这个很像是蛋白质，
但是我的template是合成的DNA，不存在蛋白质。难道这些沉淀是polymerase或者
buffer里面的BSA什么的（如果有BSA的话）
用的是Stratagene的Herculase.大家有类似的经验么？
谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer? |
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