p******x
发帖数: 1264 | 1 0.25m Ci的p32标记过的dCTP,southernblot常用。 |
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G***G
发帖数: 16778 | 2 i am asking some questions about the principle of pyrosequencing.
there are four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTP).
each time one of them will be incorporated with the DNA strand.
but we don't know what type of nucleotide is in the DNA strand.
My question is the following.
1) Do we add all the four dNTPs to the reaction each time?
by 'each time' I mean each position of unknown nucleotide in the DNA strand.
2) or we add dATP, then dGTP, then dCTP, then dTTP each time?
3) do we need to... 阅读全帖 |
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u***a
发帖数: 9 | 3 dATP,dCTP,dGTP,dTTP are manually added into four different catridges. During
the reaction, 4 dNTPS are sequentially added into the reaction system. The
machine will detect which one is complement with the template, then show it
up. |
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w********r
发帖数: 1431 | 4 对高GC的PCR，加1M betaine，dCTP/dGTP的量加倍，
然后DMSO 3-7% 和 退火温度一起，做一个二维的梯度试一下条件。
这个条件对付GC rich PCR，用了的都说好。
good luck!
ATG |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起，
加到DNA里面温浴一下就好了。 |
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q*****d
发帖数: 445 | 6 最近要做library, 使用这个实验室的方法进行易错PCR
（http://www.msg.ucsf.edu/agard/Protocols/PCR_Random_Mutagenesis.htm），酶
是NEB的Taq,但是效果一直不是很好，35 cycle PCR的浓度还是很低，30cycle特别的少
，请问
大家有什么方法提高产量吗？还是我的方法不够好，谢谢大家。
PCR Random Mutagenesis
Materials
1. Parental plasmid
2. Oligos surrounding region to be mutagenized
3. Error-prone PCR buffer (10x is 100mM Tris-HCl, pH8.3; 500mM KCl,
70mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin.)
4. 10mM MnCl2 (stock) (make sure there is no brown coloring to
stock soln; if there is it means... 阅读全帖 |
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e****p
发帖数: 354 | 7 DADIAYOU 我问一下质粒酶切后还做用P32 DCTP做PCR 吧
cheerfly 割胶回收后PCR产物做探针，PCR的模板是CDNA，用OLIGODT 反转录的话，为
什么还会28 18S 污染呢？
WWWWLZ质粒做模板还是会有这种现象，你的建议是什么呢？还是探针位点问题？
非常感谢！ |
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b********2
发帖数: 125 | 8 希望clone一段Eukaryote organism gene到其他的方便表达的receptor hosts.
查到有个kit, Superscript Plasmid system with Gateway for cDNA synthesis and
cloning. 是个好的选择吗？
这个kit里面用到了32P-dCTP，不用可以吗？有什么其他方法一样可以计算yield和size
?比如为什么不用nanodrop?
万分感谢！ |
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g*****n
发帖数: 250 | 9 看上去是还没入门。想自己甩开膀子开一片天地还不行。
1。要克隆一个基因不必建一个库。
2。用哪个KIT，取决于你下一步要干什么。
3。不知道32P-dCTP是干嘛用的，那还要上课。
4。nanodrop只是个机器，能测yield, 不能测size。 |
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C***2
发帖数: 62 | 10 大家好！ 最近做了不少southern blotting，实验过程中，操作装有放射性的dctp和标
记后的探针的tubes，手指会严重接受beta 射线的辐射，而且，还会经常做southern，
所以想买一幅具有防护性能的手套，网上查了一下，不确定，请用过的人推荐一下，
可靠的产品，十分谢谢！ |
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d****7
发帖数: 109 | 11 如sunnyday所说，加点control试试
EMSA里的学问还是挺大的，你得做做optimisation，否则结果不会好看的。
首先，你用的是nuclear extract还是纯化的蛋白？纯化的蛋白要比nuclear extract好
很多，不过如果你的蛋白不是transcription factor的话，也只能用nuclear extract
了，细节可以看看研究转录的圣经《Transcriptional Regulation in Eukaryotes:
Concepts, Strategies, and Techniqes: Concepts, Strategies and Techniques》
盐浓度也很重要，很多蛋白－DNA都是salt dependent，而且不同蛋白需要的optimal盐
浓度不一样，比如SRF我们用150 mM盐，但是150mM盐做Forkhead的话，基本上都是非常
弱的binding，调到75 mM正好适合Forkhead。所以需要做个salt titration.
另外non-specific DNA的选择也非常重要，不同的non-speci... 阅读全帖 |
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